انتشار مقالات کشاورزی و علوم وابسته

تحقيقات ميكرو RNA (يا miRNA ) بذر‌ها
چكيده :
 ميكروRNA ها مولكول‌هاي تنظيمي اساسي هستند و دربروز ژن نقش اساسي را بازي مي‌كنند. وظايف بيولوژيكي آن‌ها براي فرآيندهاي نموّي گياهان وجانوران با اهميت هستند. درباره ريز RNAها، اطلاعات اندكي وجود دارد. براي درك بهتر تنظيم بروز ژن‌هاي دانه‌ها، لازم به مشخص‌كردن تنظيم ژني مورد نياز است. miRNA ها، به عنوان مولكول‌هايي با نقش قابل توجه در اندام‌های و بافت های گیاهی شناخته شده اند.اخيراً، براي جداسازي و شناسايي به روش غير راديواكتيوي بيان ميكروRNA هاي كوچك دانه‌ها  دستور كار ساده‌اي ارائه شده است. در اين مطالعه ميكرو RNA بذر مورد تأكيد قرار گرفته است. اين تکنیک های تشخیصي، به عنوان روشي جديد براي جداسازي در  Heyn Arabidopsis thaliana (L.) در حال توسعه مي‌باشد. بذرهاي مورد استفاده در اين تجزيه وتحليل از گياه Silliquae تهيه شد. اطلاعات بيان miRNA هاي Arabidopsis وLycopersic esculentum  Mill و ژن‌هاي هدف آن‌ها نيز تجديد نظر شده است.

مقدمه
ميكروRNAها (miRNAs)، از 21 مولكول تنظيمي نوكلئوتيدي، براي اولين بار در ضمن مطالعات توسعه‌اي در Caenorhabditis elegans (Maupas) Dougherty ودرتنظيم زماني نموّ لاروي با اهميت دانسته شده‌است (Lee et al.,1993) و تازگي در تحقيقات مربوط به miRNAها تحولي به وجود آمده است. اين تركيبات در تنظيم فراشدهاي طيف گسترده‌اي از گياهان و جانوران پر اهميت دانسته شده‌است ( توسط Ambros در سال 2004 و Kinder  و Martien در 2005سال  مورد بازنگري قرارگرفته است ). ميكرو RNA ها در فرآيندهاي گوناگوني با ترشح انسولين با واسط گلوكز (Poly et al.,2004)، ريخت زايي مغز (Giraldez et al.,2005) ، سرطان (Calin et al., 2004; Gregory and Shiekhattar, 2005) يا به عنوان پاسخ گياهان به كم‌آبي، شوري، سرما، اسيد جيبرليك (GA) و اسيد آبسيسيك (ABA) را موجب مي‌گردد  (ABA)( Achard et al., 2004; Sunkar and Zhu, 2004).
جالب توجه اين‌كه اين مسيرهاي تنظيمي miRNAها براي بعضي ازبوته‌هاي بين گونه‌اي مختلف برنج (Oriza sativa L.) ، Arobidopsis thaliana (L.)Heynhحفظ شده است. و درحالي‌كه به نظر مي‌رسد، ليكوپودها (Floyd and Bowman, 2004; Axtell and Bartel,2005)، ازدولپه‌اي‌ها و تك لپه‌اي‌هاي منحصر به فردي باشند (sunkar et al., 2005)  . ميكرو RNA هاي گياهي از يك مولكول پيش ساز حلقه ساقه‌ به وسيله شبه ديسر 1 (DCL1) (Kurihara and Watanabe,2004) فرآوري شده‌اند، معمولا در حد ایده‌آل توالی كامل هدف مي‌باشند و به طورکلی كاركرد شان براي تنظیم پایین بیان ژن هدف با شکافت mRNA هدف در این مكان رقم مي‌خوردLlave et al.,2002)  . همچنين نمونه‌هايي از ميكروRNAهاي گياهي وجود دارد كه در اين سطح ترجمه عمل مي‌كنند(Aukerman and Sakai,2003; Chen, 2004). ميكروRNAها براي تنظيم بسياري از فراشدهاي گياهي دخالت مي‌كنند: مانند نموّ گل (Aukerman and Sakai,2003; Chen, 2004)، ريخت ساختي  برگ/ساقه (Palatnik et al., 2003)، توسعه ريشه (Guo et al., 2005; Wang et al., 2005)، اثر هورمون (Achard et al., 2004; Mallory et al., 2005) ونيز در توليد miRNAs (Xie et al., 2003; Vaucheret et al., 2004). گزارش‌هاي تحقيقاتي miRNA گياهان به طورعمده روي گل‌، ساقه وبرگ متمركز شده است. همچنين بذرها از نظر بيان miRNAها و كاركرد بالقوه آن‌ها در رشد و نمو و جوانه زني بايد مورد آزمون قرار گيرند. يك روش ساده براي جداسازي miRNAها ابداع گرديده و يك سيستم چندكاره غربال گيري گروه‌هاي miRNAهاي  بذرها با استفاده از كاوشگرهاي غير راديواكتيو رواج يافته است و يك دستگاه خشك‌كن كوچكي نيز براي آن فراهم گرديده‌است (Martin et al., 2005). تمام اين روش‌هاي رواج يافته، با اطلاعات مفصلي در وبسايت‌هاي سودمند براي تحقيقات  miRNAها دراين قسمت خلاصه خواهندشد. روشي كه اخيرا براي استخراج از بذرهاي درحال تكامل Arabidopsis siliquae  به منظور تشخيص miRNAهاي توسعه يافته است، نيز معرفي مي‌شوند. درنهايت، اطلاعات تازه تجزيه  miRNAs و miRNAs  ژن‌هاي هدف در درون بذرها، و قابليت‌هاي تحقيقاتي آن‌ها شرح‌داده خواهد‌شد.

 تعيين miRNA در بذرها به روش عمليات نيمه بالا
ارائه  يك  روش ساده براي جداكردن miRNAs  بذرها، با مشاهدات پيشين تهيه RNA نيز مورد استفاده قرار گرفت. در حالي كه استخراج RNA از بذرها براي تحليل بيان ژن، به صورت خشك كنندگي ژل RNA   و واكنش هاي زنجيري معكوس ترانس‌كريپتاز پلي‌مراز (RT-PCR) انجام مي‌شد، ناخالصي‌هاي پلي ساكاريد‌هاي همراه آن مشكل سازبود. در ضمن خارج‌كردن پلي‌ساكاريدها از نمونه‌هاي RNA با استفاده از ايزوپروپانول، معلوم شدكه، اسيدهاي نوكلئيك باجرم مولكولي بالا ( يعني، DNA ژنومي و RNA با جرم مولكولي بالا [mRNA and 28s and 18s rRNA, tRNA])) از مولكول‌هاي با جرم مولكولي پايين( يعني 5s rRNA, tRNA, and small RNA) به روش ايزوپروپانول جزء به جزء مي‌توانند جداشوند. چنين اطلاعاتي براي ارائه يك روش كار به نسبت ساده‌اي براي استخراج miRNA  به كار مي‌رود كه در نوشته‌هاي اخير به تفصيل شرح داده شده است (Martin et al., 2005 )، و در اينجا به طور خلاصه توصيف مي‌گردد. مرحله اول استخراج اساساً مشابه استخراج RNA به روش مرسوم فنل سديم دودسيل سولفات (SDS) است (Sombrooket al., 1989). پس از رسوب ليتيم كلرايد، miRNAs در بالاي رسوب به حالت محلول باقي ‌مي‌ماند و سپس با رسوب گيري در ايزوپروپانول 50-40 % (حجمي)  خالص‌تر مي‌گردد. بيش‌تر ناخالصي‌هاي HMW RNA و  DNA آن با رسوب‌گيري در حلال ايزوپروپانول 40% حجمي بيرون رانده مي‌شود. LMW RNA  ( RNA باجرم مولكولي  پايين) كه در محلول رويي باقي مي‌ماند و در رسوب‌گيري نهايي با ايزو پروپانول 50% حجمي رسوب مي‌كند. اين رسوب جمع‌آوري مي‌شود و با اتانول 80% حجمي شسته شده و سپس خشك شده ودرآب يا حلال فرماميد حل مي‌گردد. آنگاه اين miRNA دردستكاه الكتروفورز بر روي ژل پلي اكريل آميد 17% جرمي- حجمي محتوي اوره 7 مولار مجزا گرديده، با استفاده از واحد انتقال نيمه جامد (Bio-Rad Laboratories,Hercules,California, USA) به سمت يك غشاي با بار مثبت ( Hybond-N+, Amersham Biosciences, Piscataway, New Jersey, USA) انتقال مي‌يابد و UV تقاطع با آن رانشان مي‌دهد ( براي راهنمايي مفصل‌تر نوشته مارتين و همكاران، 2005راببينيد).
 چون ميكرو آرايه‌هاي miRNA تجارتي براي تجزيه miRNA گياه دردسترس نيست، براي توانايي نيمه بالا تحليل بيان miRNAs  در بذرها، روش ديگري توسعه يافته‌است. يك سيستم باتر (Immunetis, Boton,Massachusetts,USA)، كه معمولا براي غربال‌گري آنتي‌بادي‌هاي مونوكلونال مورد استفاده قرار مي‌گيرد، براي غربالگري هم‌زمان miRNAهاي متعددي مورداستفاده قرار گرفت. سيستم باتر داراي چاهك‌هايي است كه به طور همزمان مي‌توان 16 پروب را در آن‌ها به كاربرد، شكل a1- 37 Martin et al., 2005)). اساسا، LMW RNA با انتقال به سمت غشاء با بار مثبت از روي ژل آماده  جدا مي‌گردد. غشاء در يك ظرف پيش هيبريداسيوني قرارداده مي‌شود و سپس براي هيبريداسيون وارد يك سيستم محافظت شده‌اي مي‌گردد.  
 
شكل سيستم Immunetics miniblotler
تقريبا 170 ميكروليتر محلوب پروب به چاهك‌ها اضافه شده است. شستشو مي‌تواند به روش northern blotting بااستفاده از 2×ssc  2/0 % وزني :حجمي SDS در دماي 65 درجه انجام شود.
دراين سيستم استفاده از پروب‌هاي راديواكتيو ميسر نيست، تهيه پروب‌هاي غيرراديواكتيو تا اندازه‌اي حساس براي غربالگري ضرورت مي‌يابد. اين كار مي‌تواند با استفاده از T7 RNA پليمراز و RNA ديگوكسي ژنين مخلوط برچسب استفاده كرد(Roche Applied Science, Indinapolis, Indiana,USA). براي اين منظور، الگوهاي DNA (oligomers) براساس توالي‌هاي شناخته شده miRNA صورت مي‌گيرد كه در وبسايت miRBase موسسه سانگر مي‌تواند يافت شود ( http://microrna.sanger.ac.uk/)(Table 37.1). روش تهيه پروب تغيير يافته ( اصلاح شده ) با استفاده از كيت ساخت پروب  mirVanaTMmiRNA(Ambion, Austin, Texas,USA) براي تهيه موفقيت‌آميز پروب‌هاي miRNA غيرراديواكتيو استفاده مي‌شود (Martinetal., 2005).
غربالگري ايمونتيك شناسايي بيان miRNA هاي بذر را امكان پذير مي‌سازد. قسمت عمده‌اي از بيان miRNA ها در جوانه‌زني بذرهاي گوجه‌فرنگي (Lycopersicon esculentu Mill) و نشاءهاي آن بااستفاده ازاين روش تشخيص داده‌شده است. شكل b37.1 مثالي از يك غشاي تهيه شده اوليه با miRNA هاي استخراجي از نشاء هاي بذرهاي گوجه‌فرنگي را نمايش مي‌دهد كه براي پروب‌هاي miRNA هاي مختلف هيبريد ارائه ‌شده است. جالب‌ توجه اين كه، نمونه‌هاي مشابه‌اي در بيان miRNA بذرهاي Arabidopsis و گوجه‌فرنگي مشاهده‌شده است، نظر براين است كه اين miRNA ها در جوانه‌زني بذرها مي‌توانند نقش مهمي ايفا نمايند ( R.C.Martin, P.P. Liu and H. Nonogaki,  نتايج انتشار نيافته ).
روش‌هاي توصيف شده در بالا را مي‌توان براي بذرهاي در حال نموّ مورد استفاده قرار داد. درحال حاضر، غربالگري ايمونتيك براي تشخيص بيان  miRNA ها در siliquae Arabidopsis به كار برده شده است. با اين حال، استفاده كامل از siliquae براي تجزيه و تحليل بيان  miRNA به دليل ناخالصي‌هاي siliquae درآن ممكن است استنتاج نادرستي را ببار آورد. علاوه براين ، دستور كار بذرهاي درحال نمو siliquae منوط به صرف وقت زيادي است. اخيرا، يك روش ساده‌اي براي بذر از Arabidopsis siliquae توسعه يافته است(شكل 37.2). siliquae كه مي‌تواند بر پايه مرحله و اندازه، گروه‌بندي گردد، بادقت در امتداد اتصال بين دوقسمت چسبيده آن با چاقور جراحي از هم باز مي‌گردد. سپس Siliquae بازشده درداخل آب محتوي شن ريز ( ذرات شني s-9887; sigma, st. Louis, Missouri,USA) و آن را چندي بار روي شيكر ورتكس، در هربار چند ثانيه  به آرامي تكان مي‌دهند تا دانه‌ها در داخل آب آزاد گردند. به طوري‌كه ذرات  ته نشين شده و بذرها كه سبك‌تر از آب هستند در سطح شن تجمع مي‌يابند و مي‌توان آن‌ها را با يك پي‌پت جمع‌آوري كرد.RNA LMW و HMW RNA ها هردو به طور موفقيت‌آميزي از بذهاي درحال تكامل  با استفاده از اين روش استخراج شدند ( P.-P. Liu, R.C. Martin and H. Nonogaki, انتشار نيافته).
            (a)  (b)
   شكل1-37: (a) سيستم Immunetics miniblotler . دو غشاء مرطوب پيش‌هيبريد شد‌ه‌اي ما بين صفحات پلاستيكي محكم شده‌اند. بين غشاء‌ها و پايه صفحه از محلول تامپون پوشانده شده‌است. پس از برداشتن محلول پيش‌هيبريدكننده اضافي از چاهك‌ها با استفاده از نوك پي‌ پت µl200 متصل به خلاء ساز دستي، مقدار µl170 محلول پروب براي هيبريدسازي در داخل هركدام از چاهك‌ها قرار مي‌دهند. (b) نمونه‌اي از يك غشاء با سيستم غربالگري Immunetics هيبريد گرديد. باندها به توسط لومينسانس شيميايي برروي فيلم اشعه ايكس قابل مشاهده شدند.

جدول 1-37 وب-سايت‌هاي سودمند در تحقيق miRNA.
نام وب-سايت نشاني وي-سايت
مر كز سرطان‌شناسي Memorial Sloan-Kettering، مركز زيست‌ شناسي محاسبات http://www.microrna.org/

RNAi@elegansNet http://c.elegans.tripod.com/RNAi.htm

موسسه sanger miRBase http://microrna.sanger.ac.uk/

پروژه RNA كوچك Arabidopsis http://asrp.cgrb.oregonstate.edu/dp/

صفحه خانگي Berti,sLab http://web.wi.mit.edu/bartel/pub/

آزمايشگاه McManus http://itsa.ucsf.edu/micro/faculty/
McManus/miRarrays.html

آيا miRNA ها در بذرها حضور دارند، چگونه؟
تاكنون معلوم شده است كه miRNAها نقش مهمي در نمو گياه برعهده دارند. تشخيص بيان miRNAها در بذرها به وسيله خود آن‌ها، اطلاعات زيادي را در جهت درك بهتر زيست‌شناختي تكامل وجوانه‌زني بذر در اختيار قرار نمي‌دهد. توصيف الگوهاي بيان ژن هدف miRNA و وظايف زيست‌شناختي آن‌ها در بذور مطابق شرح مرحله بعدي ضروري است. خوشبختانه، در گياهان، مناطق ژن‌هاي هدف miRNA كه داراي توالي‌هاي miRNA مكمل هستند، تقريباً باهم جورمي‌باشند و با كامپيوتر قابل پيشگويي هستند(Reinhort et al., 2002; Rhoades et al., 2002). براي مثال، mir156 و mir157 هردو آن‌ها كه در جوانه‌زني بذور Arabidopsis بيان مي‌شوند( گزارش‌هاي منتشر نشده R. C. Martin, P. P. Lin and H. Nonogaki). براي هدف SQUAMOSA پروموتر متصل به ژن  پروتئين ماننديSPL) ) پيش‌بيني گرديده است (جدول 2-37).
جدول 2-37 miRNA- هايي كه در جوانه‌زني بذور و بذرهاي جوانه زده Arabidopsis و اهداف پيشگويي آن‌ها تشخيص داده‌ شدند. miRNA ها با استفاده از روش‌هاي غربالگري Immunetics تشخيص داده شدند ( داده‌ها نشان داده ‌نشده ‌است).
miR 156 پروموتر  SQUAMOSA متصل به جسم پروتئين مانند (SPL)a كنترل گل دهي
miR 157 پروموتر  SQUAMOSA متصل به جسم پروتئين مانند (SPL)a كنترل گل دهي
miR 162 DICER-LIKE1 (KCL)b پردازنده miRN
miR165 Homeodomain-leucine zipper protein (HD-ZIPIII)a قطبيت برگ، توسعه آوندي
miR 166 Homeodomain-leucine zipper protein (HD-ZIPIII)a قطبيت برگ، توسعه آوندي
miR 173 رونويسي مولد فعال‌كننده Trans siRNA (TAS1، TAS2) مولد ta-siRNA
miR 319 عامل ترجمه‌كننده مارپيچ-حلقه-مارپيچ (TCP)d توسعه برگ
miR 390 رونويسي مولد فعال‌كننده Trans siRNA (TAS3)d مولد ta-siRNA
a Rhoades et al., (2002); b Xie et al., (2002; c allen et al., (2005); d Palatnik et al. (2003).               
اين پروتئين‌ها به يك گروه عاملي ترجمه‌كننده تعلق دارند و معمولاً با نقشي كه آن‌ها در نموّ گل بر عهده دارند، تشخيص داده مي‌شوند. SQUAMOSA  متصل به پروتئين‌هاي 1 و 2 در Antirrhinum
 
شكل 2-37 استخراج بذرهاي رسيدهsiliquae  Arabidopsis. (a) شكل نمايش استفاده از Siliquae به عنوان يك مرحله مقدماتي استخراج بذر. Siliquae با استفاده از يك تيغ تيز حرّاحي از شيار آن باز مي‌شود. (b) و (c) Siliquae باز شده محتوي بذور سالم و كامل مي‌باشد. (d) نمايش استخراج بذر. Siliquae بازشده به داخل يك لوله پلاستيكي (15 يا 50 ميلي ليتري ) محتوي آب و ذرات شن انتقال داده مي‌‌يابد و با استفاده از ورتكس اندكي تكان داده مي‌شود. ذرات شن با Siliquae باز برخورد كرده و و آن را به داخل آب آزاد مي‌كند. Siliquae را با پنس مي‌توان از آب بيرون كشيد. چون ذرات شن سريع‌ تراز بذور ته‌نشين مي‌گردند، بذور استخراج شده از روي سطح شن قابل بازيابي بوده و مي‌تواند با پي پت جمع‌آوري شود.     
 majus به منظور شناسايي اتصال به  SQUAMOSA، يك ژن باهويت مريستم گل به طور ابتكاري تشخيص داده شد(Klein et al., 1996). شانزده همولوگ Arabidopsis از SPL تشخيص داده شدند كه 10 تاي آن‌ها داراي miR 156 مكان مكمل بودند ( شكل 3-37). بنابراين، تعيين اين‌كه كداميك از 10 همولوگ‌ در خلال جوانه‌زني براي درك نقش miR 156 در جوانه‌زني بيان شوند، ضروري به نظر رسيد ( بعداً شرح داده خواهد شد). miR 162 كه در جوانه‌زني بذور Arabidopsis و گوجه فرنگي ( داده‌ها نشان داده نشده است) شناسايي گرديد كه Dicer-Like 1 هدف را نشان مي‌داد (DCL1) (Xiet al., 2003). جالب توجه اين كه DCL1 (شبه ديسر1) در فرآيند پيش miRNA به شكل miRNA طبيعي تشكيل مي‌‌شود. براي فراهم شدن يك تنظيم فيدبك (باز خورد) منفي براي DCL1 تا اين كه  پروتئين  افزايش يابد   DCL1و miRNA بيش‌تري توليد مي‌شود و DCL1 mRNA شكافته‌ مي‌گردد. با سطوح كاهش يافته پروتئين DCL1، miRNA كمي توليد مي‌شود، و پايداري DCL1 mRNA و ترجمه آن به پروتئين تشديد مي‌گردد ( Xiet al., 2003 ).miR 165/166  نيز در بذور درحال تكامل Arabidopsis بيان مي‌شود و براي شناخت خانواده ژن هدف عامل ترجمه HD-ZIPIII به كار مي‌رود كه مناظر‌هاي گوناگون برگ، بافت آوندي وتكامل گل در Arabidopsis را ايجاد مي‌كند (Mcconnell et al., 2001; Reinhart et al., 2002; Rhoades et al., 2002; Emery et al., 2003). عوامل ترجمه ازخانواده  TCP كه شامل يك طرح پايه پيچ-حلقه-پيچ (Helix-Loop-Helix) (bHLH) هستند كه در تكثيرمريستم درگير مي‌باشند و هدف miR 319  قرار مي‌گيرد ( Cubas et al., 1999; Palatnik et al., 2003).
 
شكل 3-37 هم‌ترازي توالي‌هاي هدف miRNA در خانواده ژن SPL. بازهاي مورد بحث بارنگ زمينه سياه مشخص شده‌اند.
 اگرچه miRNA ها بانقش تنظيم كنندگي منفي‌شان شناخته مي‌شوند، اما گزارش‌هاي اخير از نقشي را كه براي miRNAها در توليد عمل تداخل كوتاه RNA دخالت دارند(ta-siRNA)(trans-acting short interfering)  پشتيباني مي‌كنند.  miR173 وهم miRNA هردو در جوانه‌زني بذرهاي Arabidopsis و گوجه فرنگي و نشاءهايشان تشخيص داده شده‌اند ( نتايج انتشار نيافته R. C. Martin, P.-P. Liu and H. Nonogaki)، به عنوان ta-siRNA هدف توليدكنندگي رونويسي (به ترتيب  TAS1  يا  TSA2 و TSA3) شناخته شده‌اند(Allen et al., 2005). اين miRNA ها پيش رونوشت‌هاي ta-siRNA هدف قرار مي‌گيرند و منخر به توليد ta-siRNA مي‌شود، كه بعداً ژن‌هاي ديگري را به طور منفي تنظيم مي‌كند. جالب اين‌كه، هدف‌هاي TAS3، عامل 3 و 4 mRNA، پاسخ به اكسين (ARF3 و ARF4) است كه در خلال آشكارسازي اكسين رشدي گياه و تكامل آن بسيار اهميت دارد. TasiR-ARF، كه همسان TAS3 است، نيز از راه داده‌هاي تجزيه پايه تعيين شده و براي هدف ARF2، ARF3،   ARF4نشان داده ‌مي‌شود( Williamset al.,2005). ژن‌هاي miRNAها و ژن‌هاي هدف miRNA در جدول 2-37 خلاصه شده است.
پس از شناسايي خانواده‌هاي اصلي miRNAهاي بيان شده در بذرها، Pri- و Pre-miRNA به وسيله RT-PCR مي‌تواند بهبوديابد و براي شناسايي تعدادي از خانواده‌هاي ژني miRNA كه در بذرها ترجمه مي‌شوند، مرتب گردند( Schmittgen et al., 2004). در شكل a 4-37 و b  يااين‌كه، امكان بهره گرفتن از َ5 و َ3 بهبود سريع انتهايي ساخت cDNA (RACE) با پرايمرهاي پاسخ دهنده‌اي براي مجبور كردن مكان‌هاي miRNAهاي واقعي، در جداكردن ژن‌هاي پاسخ‌دهنده به بيان miRNA در بذرها طراحي شده است. اطلاعات براي اختصاصي كردن فضايي – زماني بيان ژن miRNA با استفاده از ترسيم پروموتر: گزارشگري مورد نياز خواهد بود. چون اغلب miRNAهاي هدف يك خانواده ژني، براي تشخيص بيان ژن هدف اختصاصي به ويژه در بذور نيز ضروري است. براي نمونه، 10 ژن SPL مختلفي وجود دارد كه اهداف بالقوه اي براي miR 156 محسوب مي‌گردد( شكل 3-37). در گياهان، اغلب اوقات miRNAها، ژن‌هاي هدف را به توسط ميانجيگري شكافت mRNAها در جهت منفي تنظيم مي‌كنند. يك روش 5Race براي تقويت اجزاي متفرّق حاصل از شكاف حدواسط miRNA ممكن است مورد استفاده قرار گيرد، تا بتواند براي تشخيص ژن‌هاي هدف اختصاصي مرتب شود( Llave et al., 2002). بنابر اين، استفاده از آن براي به دست آوردن توالي ژن بيان شده و مناطق پروموتر ژن هدف آن، براي آزمايش‌هاي آتي ضروري خواهد بود.
 هدف نهايي اين آزمون‌ها تعيين نقش‌هاي زيست شناختي miRNAها وژن‌هاي هدف miRBAها در تكامل و جوانه‌زني بذور مي‌باشد. روش‌هاي مشتركي براي تجزيه تحليل عملكرد ژن اعم از كار افتادن و يا حداكثر بيان موتانت‌ها و آزمون فنوتيپي نتاج وجود دارد. بعضي از ژن‌هاي هدف miRNA از نظر  كاركرد‌شان افزايشي مي‌باشند(Miller and Gubler, 2005; Okushima et al., 2005)، بنابراين، چنين روش‌هايي نمي‌توانند كاربردي باشند. آزمون‌هاي بيان ژن هدف نيز داراي چالش‌هاي بالقوه‌اي مي‌باشند، زيرا miRNA، ممكن است به فراواني در بافت‌ها موجود باشند، كه هنوز هم درسركوب تظاهر miRNA هدف تواتايي كافي داشته باشند.همچنين بيان شديد، با استفاده از پروموتر سازنده مانند CaMV35S، درصورتي كه ژن داراي عملكردي درداخل بافت‌ها، درجايي كه به صورت غير نرمال بيان گردد، مي‌تواند موجب اثرات Peiotropic شود.يك روش معمول براي مشخص كردن عملكرد ژن هدف  miRNA درجهش‌زايي مكان‌هاي مكمل miRNA براي ژن هدف است كه بيان اين ژن جهش‌يافته طوري مي‌باشد كه miRNA نه خيلي بلند قادر به شكافت miRNA هدف گردد (شكل c4-37). تشكيل
 
شكل 4-37 (a) نمايش ساختار ثانويه يك مولكول pre-miRNA. (b) نمايش طرح پرايمري براي RT-PCR براي تقويت رونويسي miRNA يا pri-miRNA. پرايمرهاي پيش‌برنده معكوس با يك چنين روشي كه توالي miRNA طبيعي بين 2 پرايمرنشان داده ‌شده است (برجسته با خط ضخيم) مي‌تواند طراحي شود.(c) نمايش ساختار miRNA ژن هدف مكان موتاژن زايي. بالايي: ژن هدف miRNA بدون جهش مشتق به وسيله پروموتر سازنده CaMV 35S، مياني: متمم miRNA ژن هدف مكانموتاژن‌زايي مشتق از پروموتر 35 S، پاييني: متمم miRNA ژن هدف مكان موتاژن‌زايي مشتق از خود پروموتر.  
دهنده ژن هدف موتانت در برخي موارد حاوي اطلاعات مهمي بوده است (Achard et al., 2004;Chen, 2004; Laufs et al., 2004; Guo et al., 2005)، ولي در موارد ديگري بر روي فنوتيپ گياه نيزمي‌تواند اثرات Pleiotropic برجاي بگذارد(Wang etal., 2005). با اين حال، درصورتي كه پرومترمعتبر و منطقه غير كدگذاري َ3 ژن هدف miRNA به كار مي‌رود، آن‌گاه اين ژن در زماني كه بايستي به طور عادي به وسيله miRNA تنظيم شود، دقيقا مجاز به بيان مي باشد(Palatnik et al., 2003;Mallory et al., 2004, 2005). اين كار نقش‌هاي miRNAها و ژن‌هاي هدف را در رشد گياه و تكامل آن بهتر نشان مي‌دهد. چنين رويكردي نيز براي تحقيقات miRNA بذرها بسيار اميدواركننده مي‌باشد.
دانش جهاني  miRNA در عرصه‌هاي تحقيقاتي به سرعت در حال پيشرفت است. گروه‌هاي زيادي در زمينه‌هاي مختلف وظايف miRNA و تحليل آن وجود دارد. تعدادي از اين گروه‌ها داراي وب-سايت‌هايي هستند (جدول1-37) كه حاوي اطلاعات سودمندي براي كساني است كه درگير تحقيق miRNA مي‌باشند
تقدير نامه ها
ما از جيمز كارينگتون، Zhixin Xie و ادوارد آلن، مركز تحقيقات ژنوم و محاسبا ت زيستي در OSU به خاطرمشاوره و بحث مفيد، سپاسگزاري مي‌نماييم. اين كار با حمايت مالي بنياد ملي علوم IBN- 0237562 to H. Nonogaki انجام شده است.
منابع
   Achard, P., Herr, A., Baulcombe, D.C. and Harberd, N.P. (2004) Modulation of floral development
by a gibberellin-regulated microRNA. Development 131, 3357–3365.
Allen, E., Xie, Z., Gustafson, A.M. and Carrington, J.C. (2005) microRNA-directed phasing during
trans-acting siRNA biogenesis in plants. Cell 121, 207–221.
Ambros, V. (2004) The functions of animal microRNAs. Nature 431, 350–355.
Aukerman, M.J. and Sakai, H. (2003) Regulation of flowering time and floral organ identity by a
microRNA and its APETALA2-like target genes. The Plant Cell 15, 2730–2741.
Axtell, M.J. and Bartel, D.P. (2005) Antiquity of microRNAs and their targets in land plants. The
Plant Cell 17, 1658–1673.
Calin, G.A., Sevignani, C., Dumitru, C.D., Hyslop, T., Noch, E., Yendamuri, S., Shimizu, M.,
Rattan, S., Bullrich, F., Negrini, M. and Croce, C.M. (2004) Human microRNA genes are frequently
located at fragile sites and genomic regions involved in cancers. Proceedings of the National
Academy of Sciences of the United States of America 101, 2999–3004.
Chen, X. (2004) A microRNA as a translational repressor of APETALA2 in Arabidopsis flower development.
Science 303, 2022–2025.
Cubas, P., Lauter, N., Doebley, J. and Coen, E. (1999) The TCP domain: a motif found in proteins
regulating plant growth and development. The Plant Journal 18, 215–222.
Emery, J.F., Floyd, S.K., Alvarez, J., Eshed, Y., Hawker, N.P., Izhaki, A., Baum, S.F. and Bowman,
J.L. (2003) Radial patterning of Arabidopsis shoots by class III HDZIP and KANADI genes. Current
Biology 13, 1768–1774.
Floyd, S.K. and Bowman, J.L. (2004) Gene regulation: ancient microRNA target sequences in plants.
Nature 428, 485–486.
Giraldez, A.J., Cinalli, R.M., Glasner, M.E., Enright, A. J., Thomson, J.M., Baskerville, S., Hammond,
S.M., Bartel, D.P. and Schier, A.F. (2005) MicroRNAs regulate brain morphogenesis in zebrafish.
Science 308, 833–838.
Gregory, R.I. and Shiekhattar, R. (2005) MicroRNA biogenesis and cancer. Cancer Research 65,
3509–3512