توليد برنج هيبريد - ارائه دهنده: محمود صيادي فتمه سري

 

دانشگاه جامع علمي كاربردي

موسسه آموزش‌هاي علمي كاربردي كشاورزي-  مجتمع آموزش عالي جهاد كشاورزي استان گيلان

 

پــــروژه :

دوره كارشناسي زراعت برنج

عنــوان :

تولید برنج هیبرید

 

استاد راهنما : مهندس اسماعيل پوركاظم

 

              ارائه دهنده: محمود صیادی فتمه سري

 

 

                                                              پاييز 1387

 

فهرست                                                                                                         صفحه

 

مقدمه ................................................................................................................  2

تاریخچه برنج هیبرید .........................................................................................  3

مشخصات گیاهشناسی .......................................................................................  3

هتروزیس در برنج .............................................................................................  4

روشهای نرعقیمی در برنج .................................................................................  5

بذرپاشی لاین های والدینی در خزانه.................................................................. 10

زمانهای مختلف بذر پاشی برای تولید بذر........................................................... 11

مزرعه تولید بذر نرعقیم سیتوپلاسمی و بذر هیبرید برنج....................................... 12

نشاءکاری........................................................................................................... 13

مدیریت مزارع تولید بذر..................................................................................... 16

حذف بوته های خارج از تیپ............................................................................. 17

چیدن برگ های پرچم....................................................................................... 20

کاربرد اسید جیبرلیک........................................................................................ 21

گرده افشانی تکمیلی.......................................................................................... 25

برداشت بذور هیبرید........................................................................................... 28

خرمنکوبی.......................................................................................................... 29

منابع................................................................................................................... 31

 

مقدمه:

برنج يكي از مهمترين منابع غذايي مردم در سطح جهان مي باشد ودر سطحي بالغ بر 146 ميليون هكتار كشت مي گردد وميزان توليد آن نيز بالغ بر 520 ميليون تن در هكتار مي باشد.دو سوم كالري روزانه مردم در مناطق آسيا ويك سوم كالري مورد نياز مردم در آمريكاي لاتين وآفريقا از طريق مصرف برنج تامين مي شود(3). پس از شناخت ژن هاي پا كوتاهي و وقوع انقلاب سبز، عملكرد برنج در حدود 4/2 درصد در سال افزايش يافته است(6). يكي از مهمترين پيشرفت هاي انجام شده در زمينه اصلاح گياهان زراعي، توليد گياهان هيبريد مي باشد كه براي اولين بار حدود سال 1930 در مورد ذرت انجام پذيرفت.اين امر اصلاح گران را تشويق نمود تا بدنبال پديده هتروزيس در ساير محصولات باشند(4).

     سورگوم، ارزن، پنبه، آفتابگردان، گوجه فرنگي، بادمجان، فلفل، پياز،چغندر قند وبرنج از محصولاتي هستند كه در آنها ازخاصیت هيبريد بطور گسترده اي استفاده مي شود(7). اصلاح برنج هيبريد واستفاده از پديده هتروزيس يكي از راه هاي دستيابي به افزايش توليد برنج، متناسب با نرخ رشد جمعيت مي باشد. اگرچه پديده هتروزيس در برنج از سال 1926 شناسايي شده است، اما استفاده تجاري از آن زماني آغاز شد كه دانشمندان چيني مدعي شدند كه ارقام برنج هيبريد داراي 20 الي 30 درصد افزايش توليد نسبت به ارقام پا كوتاه هستند(2).لازم به ذكر است كه چنين عملكردي در شرايط عادي واعمال مديريت زراعي يكسان بدست آمد.

     سطح زير كشت برنج هيبريد در سال 1991 در چين به 17 ميليون هكتار رسيد واين ميزان مساحت یعنی، 55 درصد سطح زير كشت برنج و66 درصد توليد كل برنج در چين باعث گرديد كه موسسه
بين المللي تحقيقات برنج وساير  مراكز تحقيقاتي برنج در اوايل دهه 1980 فعاليت خود را در زمينه اصلاح واستفاده از تكنولوژي توليد برنج هيبريد آغاز كند(6)    

تاريخچه برنج هيبريد:

      سابقه شناسايي هتروزيس به گياهان دگربارور بر ميگردد و گزارشات در اوايل 1700 ميلادي به صورت بهبود بنيه و نمود حاصل از تلاقي براي تعدادي از گونه ها موجود ميباشد . همچنين مندل(1865)و داروين(1877) نيز در ازمايشات خود ، برتري دورگ را در بسياري از هيبريد ها يافتند . زمينه اصلي براي گسترش تجارتي پديده هتروزيس در سال 1910 در گياه ذرت مهيا گرديد . اين گياه از نخستين محصولاتي بود كه توليد بذر هيبريد در ان مورد توجه قرار گرفت (7) .پديده هتروزيس در برنج از سال 1926 شناسايي شد. اما استفاده تجاري از آن زماني آغاز شد كه دانشمندان چيني مدعي شدند كه ارقام برنج هيبريد داراي 20 الي 30  درصد افزايش توليدنسبت به ارقام پا كوتاه هستند(3). در ايران اولين گام تحقيقات برنج هيبريد در سال 1366 در ايستگاه تحقيقات برنج رشت در گيلان و آمل در مازندران با وارد نمودن دو لاين نر عقيم به نامهاي V20A و W32A توسط صالحي وهمكاران وسري دوم لاين هاي جديد نر عقيم به نام هاي IR58025A وIR28298A نيز توسط درستي ونعمت زاده از ايري(IRRI) در خواست وبه ايران وارد ودر مراكز تحقيقاتي برنج رشت وآمل مورد ارزيابي قرار گرفت(2). در سال 1375 پرو‍ژه ملي برنج هيبريد با تلاش فراوان بصورت مشترك به تصويب دانشكده علوم كشاورزي ساري و موسسه تحقيقات برنج كشور وسازمان تحقيقات، آموزش وترويج كشاورزي رسيد(6).

مشخصات گياه شناسي برنج:

     برنج گياهي است مخصوص مناطق پر آب وگرم از رده تك لپه اي ها متعلق به قبيله لگومي فلوره وتيره گرامينه(poaceae) و زير تيره اوري زوئيده وجنس اوريزا مي باشد. جنس اوريزا داراي 25 گونه مختلف است گياه برنج از كاشت تا برداشت به 80 تا 270 روز زمان نياز دارد برنج گياهي است معمولا روز كوتاه ويكساله ولي بعضي از انواع چند ساله آن نیز موجود مي باشند. برنج داراي ساقه اي راست وتوخالي است كه ارتفاع آن بين 200-50 سانتي متر ، تعداد برگ بين 10 تا 20عدد و. قطر ساقه برنج بين 6 تا 12 ميلي متر متغير است. هر بوته برنج معمولا 4 تا 5 پنجه توليد مي‌كند واصولا توليد پنجه در برنج خيلي زياد مي باشد. برگ برنج شامل پهنك و غلاف بلندي است.زبانك يا ليگول برنج غشايي وبلند بوده ودر موقع رسيدن شكاف بر مي دارد اين زبانك غشايي سه گوش بوده و داراي طولي در حدود 15-10 ميلي متر است.

     گل آذين در برنج به صورت پانيكول بوده ودر انتها واقع شده است. از محل هر گره محور اصلي خوشه يك يا چند انشعاب اوليه بوجود مي آيد. كه بعدا از همين انشعابات اوليه، چندين انشعابات ثانويه توليد مي شود كه بعد از هر يك از اين انشعابات ثانوي يك يا چند خوشه چه يا تك گل بوجود مي‌آيد. گل شامل مادگي، پرچم ها ولوديكول ها مي باشد. مادگي شامل كلاله ها، خامه وتخمدان مي‌باشد. كلاله پري شكل از دو شاخه تشكيل يافته است. تعداد پرچم در برنج برخلاف اکثر غلات 6 عدد مي باشد. ميوه برنج گندمه بوده، بدين معني كه پوسته هاي ميوه وپوسته دانه با هم رشد مي نمايد. دانه برنج داراي رنگ هاي مختلفي از قبيل زرد، سفيد، قرمز وسياه است.وزن هزار دانه برنج در حدود
40-20 گرم است(1).

هتروزيس در برنج:

     تاكنون تنها دو روش موثر براي افزايش پتانسيل عملكرد محصولات از طريق اصلاح شناخته شده است كه يكي از آنها بهبود مورفولوژيكي گياه وديگري استفاده از هتروزيس مي باشد. اصلاح صفات مورفولوژيكي، به تنهايي پتانسيل بسيار محدودي دارد و اگر هم منحصرا از هتروزيس استفاده گردد نتايج نامطلوبي خواهد داشت. هر روش اصلاحي ديگر مانند اصلاح ملكولي نيز بايد به همراه صفات مورفولوژيكي مناسب وهتروزيس قوي باشد(7). هتروزيس را بيشتر مترادف با رشد عالي هيبريد مي‌دانند يعني برتري هيبريد هاي F1 نسبت به والدين آنها. تظاهر هتروزيس فقط در نسل اول (F1) صورت مي گيرد. بنابراين كشاورزان هر سال بايد اقدام به خريد بذر هاي هيبريد كنند(3).

هتروزيس ممكن است مثبت يا منفي باشد که در اصلاح نباتات اهميت زيادي دارد.واهميت آن به هدف اصلاحي بهنژادگر بستگي دارد. به عنوان نمونه هتروزيس مثبت براي عملكرد مفيد است در حالي كه هتروزيس منفي براي زمان رسيدن گياه ويا ارتفاع بوته اهميت دارد(5).

طبق برخي گزارشات عملكرد بالاتر در برنج هاي هيبريد بدليل هتروزيس در تعداد پانيكول و تعداد گلچه ها بود. هر چند محققان متعددي از جمله پي لايي،ويرماني وهمكاران نشان دادند كه هتروزيس در عملكرد، اصولا بدليل گلچه هاي بيشتر در پانيكول وتا حدودي بدليل وزن هزار دانه بالاتر بود وتعداد پانيكول داراي هتروزيس منفي يا غير معني دار بود(8).

روش هاي نر عقيمي در برنج:

     بكار گيري پديده نرعقيمي در توليد بذرهاي هيبريد تجارتي در برنج امري ضروري است. اگرچه روش هاي مختلف نر عقيمي در برنج شناسايي شده اند، از ميان آنها نرعقيمي سيتوپلاسمي در توسعه وتكامل فن آوري توليد بذر هيبريد نقش بيشتري دارد.به تازگي نر عقيمي ناشي از تاثير عوامل محيطي نيز در برنج شناسايي شده وتلاش قابل توجهي در اين زمينه در دست انجام است.

در مواقع خاص نيز از مواد شيميايي (گامت كش ها) در توليد نر عقيمي در برنج استفاده مي شود.

روش هاي نر عقيمي ژنتيكي وغير ژنتيكي شناخته شده براي توليد بذر هيبريد عبارتند از:

الف) نر عقيمي ژنتيكي- سيتوپلاسمي

ب) نر عقيمي ژنتيكي حساس به محيط

ج) نر عقيمي القايي يا ايجاد شده از طريق مواد شيميايي

  الف) نر عقيمي ژنتيكي- سيتوپلاسمي:

     چنين نر عقيمي، با اثر متقابل بين هسته وسيتوپلاسم بوجود مي آيد. علت اصلي آن هم وجود عامل در سيتوپلاسم است.عدم وجود عامل ايجاد كننده نر عقيمي چه در هسته، چه در سيتوپلاسم، لاين‌بارور را ايجاد مي كند.وجود برخي از ژنهاي اعاده كننده در هسته، نتايج هيبريد حاصل از تلاقي يك لاين نر عقيم سيتوپلاسمي با لاين اعاده كننده را بارور مي كند(5).

در روش نر عقيمي سيتوپلاسمي،جهت توليد برنج هيبريد از سه لاين ذيل استفاده مي شود.

1) لاين نرعقيم (A لاين):

     به نوع خاصي از لاين اصلاح شده گفته مي شود كه بساك هاي آن غير طبيعي و فاقد دانه گرده باشند ويااينكه دانه هاي گرده آن عقيم است ولي مادگي طبيعي ونرمال دارد.بنابر اين خود قادر به تشكيل بذر نمي باشد ولي اگر دانه گرده نرمال به آن برسد،توليد بذر مي كند(7).

     خوشه هاي لاين نر عقيم ممكن است بطور كامل از غلاف برگ پرچم خارج شوند ويا قسمتي از آن در غلاف برگ پرچم باقي بماند.كيسه هاي بساك آن ممكن است به رنگ زرد روشن يا سفيد چروكيده باشد ودوره گلدهي آن بيش از هفت روز نمي باشد(6).

     يك لاين نر عقيم سيتوپلاسمي خوب بايد داراي خصوصيات زير باشد:

-        نر عقيمي پايداردر محيطي كه بكار گرفته مي شود

-        سازگاري با محيطي كه در آن بذر توليد مي شود

-        قابليت خوب دگر گشني براي توليد بذر بيشتر

-        قابليت پذيرش باروري نسبت به لاين هاي مختلف يا لاين هاي اعاده كننده باروري (R )

-        قابليت تركيب پذيري خوب

-        كيفيت فيزيكوشيميايي(پخت وخوراك مطلوب) (5).

2) لاين نگهدارنده( Bلاين):

     لاين دهنده گرده مي باشد كه براي گرده افشاني لاين نرعقيم بكار مي رودو توليد بذر مي كند كه گياه حاصل از آن نرعقيم مي باشد.وجود اين لاين جهت حفظ وتكثير لاين نرعقيم ضروري است(7).

3) لاين باز گرداننده باروري( Rلاين):

اين لاين نيز دهنده گرده مي باشد و در صورت تلاقي با لاين نر عقيم توليد بذر بارور مي‌نمايد كه مي تواند در سطوح تجارتي در اختيار زارع قرار گيرد(7).

خصوصيات مطلوب لاين اعاده كننده باروري بشرح ذيل مي باشد:

-        خوشه هاي آن طويل وداراي حد اقل 125 گلچه ويا بيشتر باشد.

-        خوشه ها از برگ پرچم كاملا خارج گردند.

-        براي خروج كامل بساك ها از گلچه، ميله پرچم بايد بلند باشد.

-        بساك ها بايد بزرگ، بسته وداراي دانه گرده زيادي باشند.

-        بساك ها بايد بيشتر دانه هاي گرده را پس از خروج از گلچه آزاد نمايند (6).

ب) نر عقيمي ژنتيكي حساس به محيط يا روش دو لايني[1](EGMS)

     نر عقيمي ژنتيكي، زماني حساس به محيط است كه لاين مورد نظر در يك شرايط خاص محيطي قادر به توليد دانه گرده زنده وبارور نباشد.

انواع نر عقيمي ژنتيكي حساس به محيط:

1) نر عقيمي حساس به طول روز[2](PGMS) :

     اين نوع نر عقيمي ژنتيكي، حساس به طول روز است وبراي بروز عقيمي، به طول روز خاصي نيازمند است.براي نمونه بيشتر لاين هاي نر عقيم حساس به طول روز در شرايط روز بلند(بيش از 75/13ساعت روز) نر عقيم ودر شرايط روز كوتاه(كمتر از 75/13ساعت روز) بارور هستند.

2) نر عقيمي ژنتيكي حساس به درجه حرارت(TGMS)[3] :

     اين نوع نر عقيمي ژنتيكي،به درجه حرارت حساس است وبراي بروز عقيمي به درجه حرارت خاص نياز دارد. براي نمونه بيشتر لاين هاي نرعقيم حساس به درجه حرارت در دامنه هاي بيش از 30 درجه سانتيگراد قرار مي گيرند ودر دماي كمتر از 30 درجه سانتيگراد بارور مي شوند. نقطه بحراني بارور وعقيمي از يك ژنوتيپ به ژنوتيپ ديگر متفاوت است.

     درجه حرارت بحراني باروري در لاين هاي TGMSمتفاوت است.حداقل درجه حرارت بحراني مي تواند از 15 الي 25 روز قبل از خوشه دهي و5 الي 15 روز بعد از شروع تشكيل خوشه باشد(5).

استفاده از لاين هاي EGMS براي توليد بذر هيبريد:

     در سيستم توليد بذر هيبريدبه روش EGMS(روش دو لاين) لاين نگهدارنده وجود نداردو بوته نرعقيم با تغيير شرايط محيطي قابليت توليد بذر رادارا مي باشد بدين ترتيب كه در شرايط طول روز بلند ودرجه حرارت بالا كاملا عقيم بوده ودر طول روز كوتاه ودرجه حرارت پايين، نيمه بارور مي‌باشد. بنابراين اين لاين مي تواند در دوره عقيمي خود به عنوان لاين نر عقيم در توليد بذور هيبريد و در دوره باروري خود جهت تكثير استفاده گردد.

  از زمان شناسايي اين سيستم در كشور چين تاكنون بيش از 20 رقم برنج هيبريد دو لايني توليد ومعرفي شده است كه قابليت عملكرد بالا ومقاومت وكيفيت مطلوبي دارند.

مزاياي روش دو لايني براي توليد بذر هيبريد :

-        مراحل توليد بذر ساده مي باشد چرا كه به لاين نگهدارنده نيازي نمي باشد

 شانس توليد هيبريد هاي دلخواه تا حد زيادي افزايش مي يابد بدليل اينكه در انتخاب والدين، براي توليد هيبريد هاي جديد، آزادي عمل بيشتر است.

مطالعات نشان دادكه در روش دو لايني بيش از 97 درصد واريته هاي همان زير گونه مي توانند نقش باز گرداننده باروري يا والد پدري را ايفا كنند.در حالي كه تنها كمتر از 5 در صد واريته ها مي توانند به عنوان باز گرداننده باروري لاين هاي نر عقيم در سيستم سه لاين بكار روند.

بدليل وراثت هسته اي در عقيمي لاين هاي (TGMS) هيچ اثر منفي ناشي از سيتوپلاسم عقيم وسيتوپلاسم غالب موجود در لاين CMS[4] وجود ندارد.

     ظاهرا توليد برنج هاي هيبريد با عملكرد بيشتر،زودرس تر، كيفيت دانه بهتر ومقاومت بيشتر به آفات به وسيله روش دو لايني آسانتر از روش سه لايني مي باشد وبطور معمول برنج هاي هيبريد دو لايني در مقايسه با برنج هاي هيبريد سه لايني افزايش عملكردي حدود 5 تا 10 درصد دارند(7).

معايب روش دو لايني:

     توليد برنج به روش دو لايني احتمال عدم خلوص بذردر درجه حرارت هاي پايين تردر مرحله حساس به درجه حرارت در لاين هاي TGMSوجود دارد.بنابر اين مهمترين عامل در خلوص بذور، توليد لاين هاي TGMS با درجه حرارت هاي مناسب مي باشد كه معمولا براي مناطق معتدله 23 درجه سانتيگراد وبراي مناطق نيمه گرمسيري 24 درجه سانتيگراد مي باشد(7).

 ج) نر عقيمي ناشي از عوامل شيميايي :

     نر عقيمي ناشي از عوامل شيميايي، روش غير ژنتيكي توليد لاين هاي نر عقيم(Aلاين) است.برخي از مواد شيميايي مانع تشكيل گامت هاي زنده بارور مي شوند. اين مواد شيميايي را اصطلاحا گامت كش((Gameticide مي گويند. اين روش در اصل براي گياهاني كه داراي مكانيسمي با گل هاي دوجنسي هستندوتوليد لاين هاي نر عقيمي سيتوپلاسمي يا ژنتيكي در آنها مشكل است، بكار مي‌رود.

     در اين روش براي توليد بذر هاي هيبريد ، پايه مادري را تحت تاثير مواد شيميايي يا گامت كش قرار مي دهند در نتيجه فقط دانه هاي گرده آنها از بين مي رود وهيچ آسيبي به مادگي گل نمي رسد. براي توليد بذر هيبريد دو والد مورد نظر را به صورت رديف هاي متناوب كاشته، فقط رديف هاي مادري را در معرض گامت كش قرار مي دهند. بذر حاصل از رديف هاي مادري،دانه گرده لازم را از رديف هاي پايه پدري مي گيرد(5).

سيستم تك لايني توليد برنج هيبريد :

     از اواخر دهه 1980 استفاده از روش آپوميكسي در برنج در كشور چين آغاز گرديد وهدف،توليد هيبريدي است كه در نسل هاي آن تفرق ايجاد نگردد.بدين معني كه هتروزيس در آن تثبيت گردد.توليد برنج آپوميكت (apomict ) كه هنوز در مرحله آزمايشي مي باشد، ممكن است نيازمند روش هاي فن آوري زيستي در كنار روش هاي اصلاحي سنتي باشدو شايد تا موفقيت، راه طولاني در پيش باشد.

بذر پا شي لاين هاي والديني در خزانه:

      براي توليد نشاء كافي يك هكتار برنج هيبريد، نيازمند 15 كيلوگرم بذرA لاين و5 كيلو گرم بذر R مي باشيم(6).

     بطور كلي در سيستم سه لايني توليد برنج هيبريد، دو نوع خزانه براي كشت والدين وجود دارد. يكي از خزانه ها، خزانه حفظ وتكثير لاين نرعقيم مي باشد كه در آن لاين هاي نر عقيم ونگهدارنده نر عقيمي بطور متناوب كشت مي گردند.خزانه بعدي، خزانه توليد بذر هيبريد مي‌باشدكه لاين نرعقيم ولاين اعاده كننده باروري در آن كشت ميگردد(7).

موفقيت در تكثير لاينA يا توليد بذر هيبريد،بستگي به همزماني گلدهي لاين هاي والديني دارد. هدف از همزمان نمودن گلدهي آنست كه گل هاي لاين A ولاين B براي توليد بذر نر عقيم ويا گل هاي لاين A ولاينR براي توليد بذر هيبريد بطور همزمان باز شده وآماده پخش دانه هاي گرده سالم ويا دريافت دانه هاي گرده باشند.

هم زمان نمودن گلدهي لاين هاي والديني به دو طريق صورت مي گيرد:

-تنظيم تاريخ بذر پاشي در خزانه بر اساس طول دوره رويشي وشروع مرحله زايشي لاين هاي والديني.

- تنظيم تاريخ گلدهي با اعمال مديريت مزرعه اي (6).

زمان هاي مختلف بذر پا شي براي توليد بذر نر عقيم سيتوپلاسمي :

     لاينA يك بار ولاين  B دو بار بذر پاشي مي شود. آغاز توالي بذر پاشي از روز نخست با بذر پاشي لاين A آغاز مي گردد وبذر پاشي دور اول لاين B سه روز پس از بذر پاشي لاين Aمي باشد وبذر پاشي دور دوم لاين Bسه روز بعد از بذر پاشي دور اول لاين Bصورت مي گيرد.

زمان هاي مختلف بذر پاشي براي توليد بذر هيبريد :

     براي توليد بذر هيبريد معمولا لاين R  را در سه تاريخ متفاوت بذر پاشي مي نمايند. بذر پاشي معمولا با فاصله سه روز در ميان صورت مي گيرد. لاين A را فقط يك بار بذر پاشي مي نمايند وبذر پاشي لاين Aبا نوبت دوم بذر پاشي لاين Rهمزمان مي باشد وبايد توجه داشت كه اين موضوع بستگي كامل به دوره رويشي لاينA ولاين R  دارد وبا دانستن اين دوره بايد تاريخ بذر پاشي را تنظيم نمود.

مثال 1- پايه مادري (A لاين) داراي 10 روز دوره زراعي بيشتر از پايه پدري (R لاين) است.

شروع توالي بذر پاشي از روز نخست با بذر پاشي لاين A مي باشد. مثلا اول ارديبهشت

شروع اولين بذر پاشي لاين R 7 روز پس از بذر پاشي لاين A مي باشد، 8 ارديبهشت.

بذر پاشي دور دوم لاين Rسه روز پس از بذر پاشي دور اول لاينR ميباشد، 11 ارديبهشت.
(یعنی 10روز پس از A )

بذر پاشي دور سوم لاينR  سه روز پس از بذر پاشي دور دوم لاين Rمي باشد،
14 ارديبهشت(5).(یعنی 13 روز پس از A)

---

[1]- Environment Genetic Male Sterlity

[2] -Photoperiod Genetic Male Sterlity

[3] -Temperature Genetic Male sterlity

[4] -Cytopelasmic Male Sterlity

توليد برنج هيبريد - ارائه دهنده: محمود صيادي فتمه سري

مزرعه توليد بذرنرعقيم سيتوپلاسمي وبذرهيبريدبرنج:

  روش‌هاي مختلف ايزوله نمودن مزرعه توليد بذر هيبريد :

الف) ايزولاسيون طبيعي : عوامل توپوگرافي نظير دره و رود خانه، بهترين عامل براي حفظ خلوص A لاين مي باشد.

ب) ايزولاسيون مكاني : براي حفظ خلوص A لاين بيش از 700 متر فاصله و براي تكثير A لاين، 500 متر وبراي خلوص وتكثير والد دهنده گرده 200 متر فاصله و براي توليد بذر هيبريد (F1)، 100 متر فاصله قابل قبول مي باشد.

ج) ايزولاسيون زماني : زمان خوشه دهي اوليه يك لاين بايد حداقل 20 روز دير تر يا زودتر از واريته هاي ديگر باشد.

د) ايزولاسيون به وسيله مانع :

1- محصولات پا بلندي همچون ذرت، نيشكر وسورگوم بايد پهنای بيش از 30 متر در اطراف A لاين را پوشش دهد.

2- موانع مصنوعي مانند پارچه ايزولاسيون ويا نايلون كه اين مانع بايد حداقل 5/2 متر ارتفاع داشته باشد(7).

نشاءكاري :

      نشاء كاري بايد به عمق 2 الي 3 سانتي متر در خاك صورت گيرد.كاشت 1یا 2 نشاء در هر كپه هيچگونه تفاوتي در عملكرد گياه ايجاد نمي نمايد، مگر آنكه تك نشاء بميرد واز بين برود.

نشاء يك يا دو بوته از لاين Aدر هر كپه و نشاء كاري دو بوته از لاينB و يا R توصيه مي گردد.

رديف هاي نشاء كاري بايد عمود بر جهت وزش باد در زمان گلدهي باشد.رديف هاي انتهايي لاينB و يا R بايد يك يا دو بوته بيشتر از بوته هاي لاينA داشته باشند. نشاء كاري بايد طوري انجام گيرد كه هر بوته لاينA (در همان رديف خودش) دقيقا در بين فاصله بين دوبوته لاينB و يا R قرار گيرد، فاصله رديف ها وبوته ها كاملا ثابت ويكنواخت باشد.

A لاين

 انتقال نشاء به زمين اصلي، 21 روز پس از بذر پاشي، تاريخ خوشه دهي وگلدهي را مطمئن تر مي سازد. نشاءهاي مسن تر از 21 روز باعث تاخير در گلدهي مي شوند.يعني در حدود نصف روزهاي تاخير كرده مي باشد.نشاء كاري نشاء هاي جوان تر از 21 روز باعث جلو انداختن گلدهي مي گردد.يعني حدود نصف روز هاي جلو افتاده از 21 روز. چنانچه تاريخ نشاءكاري لاين A به تاخير بيفتد، بايد نشاء كاري لاينB و يا R  نيز به همان اندازه به تاخير بيفتد(5).

     انتخاب نسبت مناسب بين رديف هاي والد پدري ومادري اهميت زيادي در ميزان بذر توليد شده از لاين نر عقيم دارد. تعداد بوته هاي والد پدري بايد در حدي باشد كه دانه گرده كافي جهت بارور نمودن لاين مادري را داشته باشد واز طرفي نبايد آنقدر زياد باشد كه عملكرد در واحد سطح بذر هيبريد توليد شده راكاهش دهد.بطور معمول نسبت والد مادري به پدري بين
 8 : 2 تا 12 : 2مي باشد.ولي در خزانه توليد بذر هيبريد در مواردي كه طول دوره رشد والد پدري بيشتر از والد مادري باشد، مي توان تعداد خطوط كشت والد مادري را افزايش داد. زيرا لاين اعاده كننده باروري مدتي  زودتر از لاين نر عقيم كشت مي شود و همين امر موجب پنجه دهي بيشتر و تعداد پانيكول بيشتر ودر نتيجه دانه گرده زياد تر مي شود و هر چه تفاوت  طول دوره رشد لاين نر

عقيم با لاين اعاده كننده باروري  بيشتر باشد مي توان نسبت را بيشتر گرفت. به عنوان مثال در برخي از مزارع كشور چين تفاوت طول دوره رشد والد پدري ومادري به 30 روز مي رسيد به همين دليل نسبت A به R 16 به 2 يا 18 به 2 بود.

     در مزارع ديگر كه لاين اعاده كننده باروري تنها 5 روز دير رس تر از والد نرعقيم بود، نسبت رديفهاي نر به ماده 2 به 12 در نظر گرفته شد. به طور كلي به ازاي هر گلچه والد نر 4-3 گلچه برايوالد ماده در نظر مي گيرند(7).

     فاصله بين رديف نيز يكي از فاكتور هاي موثردر هم زماني گلدهي و توليد بذر مي باشد. معمولا فاصله بين دو رديف لاين نرعقيم را كمتر از فاصله دو رديف لاين پدري در نظر مي گيرند. بدين دليل كه با كاهش فاصله رديفهاي والد مادري ، پنجه هاي كمتري توليد ميشود و خوشه هاي يكنواخت و هم زمان توليد مي گردد. از طرفي با افزايش فاصله بين دو رديف والد پدري ، پنجه هاي بيشتري توليد ميگرددو زمان گلدهي و گرده افشاني طولاني تر مي شود و بالطبع در ميزان توليد بذر از لاين نرعقيم موثراست. در كشور چين معمولا فاصله بين دو رديف لاين نر عقيم را 13 سانتي متر ، فاصله بين دو لاين والد پدري را 25 سانتي متر و فاصله بين لاين نرعقيم ولاين پدري را 20 سانتي متر در نظر مي گيرند(7).

     بابهبود روشهاي توليد بذر و پيشرفت هاي انجام شده در اين زمينه ، نسبت زمين لازم براي والدين برنج هيبريدتغیيرات چشمگيري يافته است. به طوري كه نسبت مزارع F1 : A/R :A/B در دهه 1970 برابر با 1:30:1000 بود كه اكنون اين نسبت به 1:50:6000 تغيير يافته است . بدين معني كه براي 6000 هكتار مزرعه برنج هيبريد ، نياز به 50 هكتار مزرعه توليد بذر هيبريد و يك هكتار مزرعه حفظ و تكثير لاين نرعقيم مي باشد(7).

مديريت مزارع توليد بذر:

الف- مديريت كود و آبياري در برنج هيبريد:

     نبايد كودهاي اصلي (NPK) با هم مخلوط و هم زمان استفاده گردد. بلكه براي بذر هیبريد بايد كودهاي ازته (N) فسفر (P) و پتاسه (K)جداگانه مصرف گردند. همه كودهاي فسفره و پتاسه را در آخرين مرحله شخم و آماده كردن زمين ، بايد مصرف نمود.يك سوم آنرا 5 الي 7 روز بعد از نشاكاري ، يك سوم دوم را 20 الي 25 روز بعد از كود پاشي نوبت اول و سر انجام يك سوم آخر را در زمان حداكثر پنجه دهي(6).

     ارقام هيبريد در مقايسه با واريته هاي معمولي ، به حدود 20 درصد كود اوره و 30-20 درصد

 كود پتاس بيشتري نيازمندند ولی نياز فسفر آنها با هم برابر است. در بلوك هاي تلاقي والدين، در

مرحله تشكيل پانيكولهاي جوان لاين نرعقيم،كود سرك داده نمي شود به دليل آنكه از توليد پنجه

هاي غير بارور زياد، كه مي تواند بر روي همزماني گلدهي تاثير گذارد، جلوگيري گردد. همچنين

در برخي موارد مي توان به كمك كود ازته، زمان خوشه دهي را تا چند روز به تاخير انداخت ويا

بوسيله كود هاي فسفره وپتاسه خوشه دهي را2-1 روز جلو انداخت. البته بايد به خاطر داشت كه
استفاده از اين روش نيازمند دقت زياد وصرف هزينه و وقت مي باشد. چرا كه بايد كود مورد نظر را

منحصرا پاي يكي از والدين پاشيد. براي سهولت اين امر در كشور چين، كشاورزان با مخلوط كردن كود با خاك نرم اين عمل را انجام مي دهند.

     در مزرعه توليد بذر، كنترل آبياري بايد با دقت صورت پذيرد تا تكامل خوشه هاي هر دو والد

در يك زمان واقع گردد.با توجه به اينكه رطوبت نسبي بالا در طول گلدهي در مزرعه نياز مي باشد

،بنابر اين درآب و هواي گرم، آبياري ضروري است. مطالعات نشان داده است كه ميزان خروج كلاله بوته هاي نر عقيم مي تواند با استفاده از نشاء هاي قوي،تكنيك هاي كودي وآبياري مناسب افزايش يابد.در مزرعه توليد بذر هيبريد لاين اعاده كننده باروري نسبت به آب حساس مي باشد بنا براين اگر از نظر گلدهي، R لاين جلوتراز لاين نر عقيم باشد، آب موجود در مزرعه را بايد خارج نمود واگر لاين نر عقيم جلوتر باشد، مزرعه آبياري مي گردد(7).

ب- واكاري كوپه هاي از دست رفته

ج- كنترل علفهاي هرز

د- كنترل بيماريها وآفات

و- حذف بوته هاي خارج از تيپ

     بوته هاي غير تيپ ممكن است از لاينR و يا لاينA باشند.حذف بوته هاي غير تيپ باعث جلو‌گيري از گرده افشاني ناخواسته مي گردد.حذف بوته هاي غير تيپ در هر زماني كه امكان تشخيص آن باشد ضروري است(6). حذف بوته هاي خارج از تيپ از مزرعه توليد بذر قبل از گلدهي،عملي در جهت مطمئن شدن وافزايش خلوص بذر است. اين كار بايد در طول دوره رشد و نمو و در هر زماني كه لازم است صورت گيردتا از دگرگشني احتمالي بوته هاي هتروژنوس ((heterogenus جلوگيري شود(5).

 مهمترين مرحله حذف بوته هاي خارج از تيپ شامل:

-        در زمان حداكثرپنجه زني

-        در زمان گلدهي

-        دقيقا قبل از برداشت

بوته هاي خارج از تيپي كه بايد در زمان حداكثر پنجه زني حذف گردند:

. حذف گياهاني كه خارج از رديف قرار داشته باشند

. حذف بوته هايي كه بلند تر از بوته هاي اصلي و يا كوتاهتر از آنها باشند

. حذف گياهاني كه از نظر شكل واندازه برگ متفاوت باشند

. حذف گياهاني كه از نظر رنگ برگ متفاوت با بوته هاي اصلي هستند.

حذف بوته هاي خارج از تيپ در زمان گلدهي:

. حذف بوته هايي كه خيلي زود ويا خيلي ديرتر از بوته هاي اصلي به گل مي روند

. حذف بوته هاي لاين A كه داراي بساك زرد رنگ وسالم باشند.

. حذف كليه بوته هاي بيمار وآفت زده از رديف لاينA

حذف بوته هاي خارج از تيپ قبل از برداشت:

. حذف بوته هاي لاينA كه داراي دانه بندي طبيعي باشند

.حذف بوته هاي كه داراي خوشه هايي با شكل واندازه دانه متفاوت باشند

. حذف بوته هايي كه داراي ريشك و يا فاقد ريشك يعني غير از تيپ بوته هاي اصلي باشند.

 برآورد تاريخ گلدهي از طريق مراحل تشكيل خوشه(5)

مرحله	مرحله تكامل	تخمين تقريبي روز هاي گلدهي	تخمين طول خوشه
1	نخستين يا آغاز خوشه دهي	30	2/0
2	شاخه اوليه نخستين خوشه	27	4/0
3	شاخه ثانويه نخستين خوشه	24	5/1
4	مادگي واندام نر نخستين خوشه	20	2
5	سلول هاي مادري دانه گرده	17	25-10
6	تقسيم ميوزي	12	80
7	دانه گرده بالغ	6	250-190
8	مرحله رسيدن دانه گرده	4	260
9 و10	گلدهي	2-1	270

 چيدن برگهاي پرچم:

     چيدن برگهاي پرچم در مرحله آبستني گياهان، توليد بذر هيبريد، امري بسيار ضروري است. معمولادر زمان آبستني در حدود يك دوم الي يك سوم برگ پرچم وساير برگها كه هم رديف برگ پرچم هستند بوسيله داس يا قيچي چيده مي شوند (شكل 4). اين عمل (چيدن برگ پرچم) باعث تسريع در حركت دانه گرده شده وبازده دگر گشني را افزايش مي دهد.در نتيجه دانه بندي لاينA بهتر صورت مي گيرد(5).

كاربرد اسيد جيبرليك(GA3) در توليد برنج هيبريد:

     در اغلب لاينهايCMS كه منبع آنها WA است، قسمتي از خوشه درون غلاف برگ پرچم باقي مي ماند.در نتيجه اسپري كردن لاين  Aيا اسيد جيبرليك، باعث تسريع خروج خوشه از غلاف برگ پرچم مي شود. اسيد جيبرليك را بايد در دو نوبت اسپري كرد. نوبت اول وقتي كه
 5 الي 20 درصد پنجه ها شروع به خوشه دهي كردند ونوبت دوم را دو روز بعد از اسپري كردن نوبت اول انجام مي دهند(5). ميزان هورمون داخلي GA3در لاين هاي نر عقيم با سيتوپلاسم WA كمتر ازبوته هاي بارور است. بنا بر اين در اغلب لاين هاي نر عقيم تيپ اينديكا، حدود يك سوم تا يك چهارم گلچه هاي يك خوشه در غلاف برگ پرچم باقي مي مانند وخارج نمي شوند وموجب كاهش توليد بذر F1 مي گردد. دليل عدم خروج كامل خوشه از غلاف، كوتاه بودن سه ميانگره بالايي بخصوص آخرين ميانگره لاين هاي نر عقيم اينديكا نسبت به والد پدري مي باشد.

GA3 يك تنظيم كننده رشد موثر مي باشد كه موجب تغييراتي در متابوليسم هاي فيزيولوژيكي وبيوشيميايي گياه مي گردد. پاشيدن GA3بر روي يك لاين، موجب تحريك طويل شدن سلول هاي جوان مي گردد. اين هورمون در دهه 1970 به ميزان 5/7 الي 45 گرم در هكتار استفاده مي شد و در اوايل دهه1980 به 90-60 گرم در هكتار افزايش يافت.در اواخر اين دهه، اين هرمون به ميزان 375 -300 گرم در هكتار مورد استفاده قرار ميگرفت ودر دهه 1990 نيز 225 -150 گرم در هكتار پاشيدن بوسيله سمپاش پشتي و135-90 گرم در هكتار با سمپاش اتومايزر استفاده مي شد.

 مزاياي كاربرد GA3 :

1- القاي خروج خوشه و كلاله

2- حذف روش قطع برگ پرچم كه اين امر خود موجب مزاياي زير مي گردد.

الف) افزايش وزن هزار دانه

ب) كاهش دانه هاي پوك

ج) كاهش خسارت ناشي از پاتوژن ها

د)بهبود پر شدن دانه ها

و) كاهش هزينه كار گري براي حذف برگ پرچم

ه) افزايش قابل توجه تشكيل بذر وعملكرد

3-تنظيم ارتفاع بوته بذري و والد پدري

4- تسريع رشد پنجه هاي پايين وافزايش تعداد خوشه هاي موثر

5- ايجاد خوشه هاي يكدست وهماهنگ

6- تغيير زمان آغاز خوشه دهي تا دو روز جهت همزماني گلدهي

7- افزايش طول عمر وزنده ماندن كلاله ودانه گرده

     بهترين زمان استفاده از GA3زماني است كه 5-2 درصد خوشه ها به ميزان صفر الي 2 سانتي متر از يقه برگ پرچم خارج شده باشند. توصيه مي شود كه پاشيدن اين هورمون بين ساعت 10-7 صبح يا 7-5 بعد از ظهر صورت پذيرد هر چند اسپري كردن در صبح بهتر است زيرا دماي محيط پس از تيمار كردن اين هورمون بالا مي رود وبالطبع فعاليت گياه افزايش يافته وجذب بهتر صورت مي پذيرد. هورمون GA3را بايد 3-2 بار در روز هاي متوالي در مزرعه بكار بردكه در نوبت اول يك سوم ودر نوبت دوم یعنی 2روز بعد باید دو سوم باقيمانده مصرف شود.

 عوامل مختلفي در ميزان مصرف GA3در مزرعه موثرند :كه از مهمترين آنها مي توان به موارد ذيل اشاره نمود.

1- نوع لاين نرعقيم: بطور مثال ميزان GA3 در لاين نر عقيم V2OAبايد بيشتر ازZS97A باشد

2- تيپ لاينهاي نر عقيم :لاين هاي نر عقيم تيپ ژاپونيكا به ميزان هورمون كمتري نياز دارند.

3- فصل رشد : در برخي مناطق كه چند بار در سال برنج كشت مي گرددميزان مصرف GA3 در فصول سرد بيشتر از فصل گرم مي باشد.همچنين در فصول مشابه، در مناطق گرم ميزان مصرف كمتر است.

4- تعداد خوشه هاي موثر : كه با افزايش خوشه ها، ميزان مصرف بيشتر مي‌شود.

5- مقدار ماده فعال موجود در GA3

6- نحوه پاشيدن

ميزان آب مزرعه در زمان تيمار با GA3بايد 5-3 سانتيمتر باشد. همچنين همراه با اين هورمون 15- 5/7 كيلو گرم در هكتار كود اوره و 3 كيلوگرم در هكتار كود فسفات پتاسيم مصرف مي گردد.گاهي اوقات لازم است جهت تنظيم ارتفاع لاين هاي والديني مقادير متفاوتي از هورمون براي دو لاين بكار برده شود. ولي بايد بخاطر داشت كه مصرف بيش از اندازه اين هورمون موجب بلند ونازك شدن ميانگره آخر و در نهايت ورس خوشه مي شود.

     اگر هورمونGA3 زودتر اززمان توصيه شده مصرف گردد بر روي رشد ميانگره هاي پايين تر تاثير گذاشته و موجب افزايش ارتفاع گياه و ورس بوته مي گردد ومصرف دير هنگام نيز تاثيري بر افزايش طول ميانگره ها ندارد.مصرف در زمان مناسب موجب رشد دو ميانگره آخر مي گردد. در مزرعه توليد بذر هيبريد، در حالي كه R لاين زودتر از لاين نرعقيم كشت شده باشد، بايد منتظر ماند تا A لاين به مرحله مناسب رشد برسد سپس تيمار GA3 را اعمال نمود ولي در برخي موارد جهت چسبندگي بيشتر اين هورمون با گياه ميتوان مقداري شكر با اين هورمون مخلوط نمود ولي بايد توجه داشت از آنجايي كه GA3يك اسيد است با يك تركيب قليايي مخلوط نگردد(7).

جيبرليك اسيد به صورت پودر مي باشد و بصورت صد در صد ويا نود درصد خالص تجارتي به فروش مي رسد. محلول جيبرليك اسيد بصورت PPM (قسمت در يك ميليون) محاسبه مي گردد مثلا اگر سه گرم از  GA3 را در 50 ليتر آب حل كنيد، محلول بدست آمده داراي غلظتي معادل 60 پي. پي ام مي باشد.

پانصد ليتر آب براي يك هكتار براي سمپاش هاي تراكتوري ضروري مي باشد.

پودر GA3 در آب حل نمي شود لذا بايد ابتدا آن را در حجم بسيار كم الكل اتانول 70% حل نمود وسپس با آب مخلوط كرد.

چند قطره مايع ظرفشويي ويا لباسشويي نيز بايد به آن اضافه گردد زيرا مايع پاك كننده باعث چسبيدن GA3 به سطح برگ مي گردد وباعث بالا رفتن كار آيي آن مي شود(6).

گرده افشاني تكميلي :

     گرده افشاني تكميلي در زمان گلدهي وبا تكان دادن گياه (رديف ها) با طناب ويا بايك چوب بلند صورت مي گيرد(شكل 6 و7). اين كار نه تنها باعث گسترش دامنه پراكنش دانه گرده مي شود بلكه باعث تحريك گياه شده و باز شدن لما وپالئا را آسانتر مي كند. سه الي چهار بار گرده افشاني تكميلي در مدت 6 الي 10 روز توصيه مي شود(5).

     پس از گرده افشاني والدين مقداري دانه گرده در پرچم باقي مي ماند كه ممكن است بسته به نوع رقم،ميزان آن متفاوت باشد.هر چه ميزان دانه گرده باقيمانده بيشتر باشد بهتر است.چرا كه درصد گرده افشاني را پس از زمان گرده افشاني معمول افزايش مي دهدمعمولا در درجه حرارت بالا و رطوبت پايين،R لاين دانه هاي گرده را بيشتر وزودتر آزاد مي كند حتي قبل از باز شدن گلوم ها ،ولي در شرايط حرارتي ورطوبتي مناسب،دانه هاي گرده در زمان مناسب آزاد مي گرددو تا مدتي ادامه مي يابد.بهترين زمان گرده افشاني تكميلي موقعي است كه بيشترين تعداد گلوم هاي باز شده را داشته باشيم. اين عمل به فاصله هر نيم ساعت و به تعداد 4-3 بار در روز و به مدت 10 روز انجام مي شود.

روش هاي گرده افشاني تكميلي:

1- با استفاده از طناب : در اين روش دو نفر دو سر طناب را گرفته و در سطح خوشه ها به آرامي حركت ميدهند.

2-با استفاده از چوب بلند ني خيزران (بامبو) : در اين روش چوب را چند بار به آرامي بر روي خوشه ها حركت مي دهند

3- با استفاده از دو چوب كوتاه : در اين روش يك فرد بين دو رديفR لاين حركت ميكند و با چوب به خوشه هاي والد پدري به سمت دو طرف مي زند تا دانه هاي گرده به سمت لاين هاي نر عقيم در دو طرف پراكنده گردد(7).

     گرده افشاني تكميلي در روزهاي آرام (زماني كه سرعت باد1 الي 3 كيلومتر در ساعت است) صورت مي گيرد.زماني كه سرعت باد درحدود 8 الي 10 كيلومتر در ساعت باشد نيازي به گرده‌افشاني تكميلي نيست. گرده افشاني تكميلي در صبح زماني كه گلچه هاي پايه پدري در حال باز شدن و نيز پايه مادري آماده دريافت دانه گرده هستند(معمولا از ساعت 5/9 الي 12 ظهر) صورت مي گيرد.

 برداشت بذور برنج هيبريد :

     برخلاف واريته هاي معمولي، برداشت بذور F1 نيازمند كار پيچيده تري است كه اگر با دقت انجام نشود، خلوص بذر F1 تحت تاثير قرار خواهد گرفت. فر آوري مناسب بذور هيبريد، معيار اصلي براي تضمين كيفيت بذور مي باشد.از طريق فرآوري، بذور علف هاي هرز، مواد زايد، بذور شكسته، بذور چروكيده، كاه وكلش و دانه هاي سنگ جدا سازي مي شود ورطوبت بذر به 13 درصد كاهش مي يابد(7).

     ابتدا بايد لاينR رابرداشت نمودو سپس لاينA برداشت گردد و بايد هر يك را جداگانه نگهداري نمود. زماني كه 90 درصد بذور بر روي ساقه كاملا سفت و رنگ آنها طلايي گرديد، بايد برداشت گردد وزمان برداشت رطوبت بذر بايد كمتر از 20 درصد باشد.

10-7 روز قبل از برداشت بذر هيبريد، مزرعه توليد بذر بايد خشك گردد. ابتدا لاين R وياB بايد برداشت شوند وبرداشت بايد به صورت دستي و با داس صورت گيرد. محصول برداشت شده لاين

R وياB را بايد كاملا از مزرعه خارج نمود و سپس به برداشت لاين A پرداخت. بايد طوري عمل كرد كه حتي يك خوشه از لاين R وياB در مزرعه توليد بذر باقي نماند(6).

معمولا جهت حفظ خلوص بذور استحصالي از لاين هاي نر عقيم، ابتدا R لاين را برداشت نموده وپس از جمع آوري وخروج از مزرعه، اقدام به برداشت Aلاين مي نمايند. با توجه به اينكه هدف اصلي در خزانه توليد بذر، برداشت بذور از لاين هاي نر عقيم است، در بسياري از مناطق چين والد پدري را حتي پس از پايان گلدهي وقبل از رسيدن كامل، برداشت نموده و دور مي ريزند.

در كشور آمريكا، شركت هاي خصوصي كه وظيفه توليد بذر هيبريد را بر عهده دارند، به علت بالا بودن هزينه كارگري، R لاين را برداشت نمي كنند وفقط لاين هاي نر عقيم برداشت مي‌شود(7).

خلوص بذر تا حد زيادي بر پتانسيل عملكرد هيبريد هاي F1 تاثير مي گذارد. مطالعات نشان داده‌است كه عملكرد برنج هيبريد به ازاي هر يك درصد ناخالصي 100-80 كيلوگرم در هكتار كاهش مي يابد در برنامه توليد برنج هيبريد، خلوص لاين هاي والديني وبذور پايه بسيار حياتي مي باشد(9).

خرمنكوبي :

   در طول برداشت، خرمنكوبي، خشك كردن وبسته بندي بذور A لاين و والد پدري بايد كاملا جدا از هم باشند و ادوات خرمنكوبي بايد قبل از شروع كار كاملا تميز باشد(شكل 8).  ضمنا براي هر كيسه بذر، دو برچسب در نظر گرفته مي شود كه يكي درون كيسه وديگري بر روي كيسه قرار داده شود وبر روي آن مشخصاتي از قبيل نام و آدرس توليد كننده، نام  رقم هيبريد، وزن خالص، تاريخ توليد،شماره مجوز توليد ذكر ميگردد. سپس اين كيسه ها در انبار تميز به ميزان حداكثر يك تن در متر مربع قرار داده مي شوند ودر صورت لزوم مي توان از سمومي نظير فسفيد آلومنيوم جهت مبارزه با آفات انباري استفاده نمود(7).

براي ذخيره سازي مطمئن، درصد رطوبت بذر را بايد به 13 درصد رسانيد. ذخيره سازي بذر هاي خشك شده براي حفظ قوه ناميه بذر خيلي مهم است.بذر خشك مانع رشد كپك وساير قارچ ها و باكتري ها مي گردد(6).

منابع مورد استفاده:

1) اله قلي پور، م - بررسي همبستگي بين برخي از صفات مهم زراعي با عملكرد از طريق تجزيه عليت دربرنج - 1376 – پایان نامه کارشناسی ارشد- انتشارات دانشكده كشاورزي دانشگاه تهران.

2) درستي، ح – گزارش نهایی  بررسي توليد بذر هيبريد (F1) -  1385 - انتشارات موسسه تحقيقات برنج كشور.

3) درستي، ح-  گزارش نهایی پروژه اصلاح و معرفي برنج هيبريد تجارتي(F1) - 1385 -انتشارات موسسه تحقيقات برنج كشور.

4) درستي، ح –گزارش نهایی  بررسي مقايسه عملكرد مقدماتي لاين هاي برتر در توليد بذور هيبريد برنج -  1379 - انتشارات موسسه تحقيقات برنج كشور.

5) نعمت زاده، ق و ولي زاده، الف – اصلاح برنج هيبريد – 1382 – انتشارات دانشگاه مازندران.

6) نعمت زاده، ق وتريز، الف- توليد بذر هيبريد برنج – 1381 – انتشارات دانشگاه مازندران.

7) نوري، م – مروري بر مباحث برنج هيبريد – 1382 – انتشارات موسسه تحقيقات برنج كشور معاونت مازندران.

 

8) Virmany,S.S – 1994 – Hetrosis and hybrid rice breeding – Springer Verlag.

 

9) Zhou,C – 2001– International training course of Hybrid rice seed production – C

بررسي بلاست برنج و روش‌هاي كنترل آن - ارائه دهنده: ابراهیم دودابی نژاد

به نام خدا

دانشگاه جامع علمي كاربردي

موسسه آموزش‌هاي علمي كاربردي كشاورزي مجتمع آموزش كشاورزي گيلان

 

پــــروژه:

دوره كارشناسي زراعت برنج

 

عنــوان :

بررسي بلاست برنج و روش‌هاي كنترل آن

 

 

تهيه و تنظيم:

ابراهيم دودابي‌نژاد

 

استاد راهنما: مهندس اسماعيل پوركاظم

استاد مشاور: دكتر صديقه موسي‌نژاد

 

زمستان 1387

 

مقدمه:

برنج يكي از مهم ترين و قديمي‌ترين محصولات زراعي است كه در دنيا كشت شده و از دانه آن به عنوان غذا استفاده مي‌گردد، بطوري كه غذاي بيش از نيمي از مردمان مناطق گرمسيري و نيمه‌گرمسيري را تشكيل مي‌دهد. برنج در دنيا داراي سابقه پنج هزار ساله بوده كه ابتدا در جنوب شرقي آسيا (هندوچين) كشت آن آغاز گرديده و سپس به ساير نقاط دنيا گسترش يافته است. در حال حاضر 90 درصد برنج دنيا در جنوب‌ شرقي آسيا توليد مي‌گردد و در خارج از آسيا كشورهاي برزيل و ايالات متحده با توليد نيم درصد برنج مصرفي جهان، داراي سابقه دو هزار ساله بوده و استان هاي گيلان و مازندران از مناطق مهم توليد برنج در ايران به شمار مي‌روند، البته غير از اين دو استان در 16 استان ديگر كشور نيز برنج كشت مي‌گردد(3).

گونه زراعي مهم برنج Oryza sativa L.  از خانواده Poaceae بوده كه داراي تنوع ژنتيكي و توان سازگاري بالايي است و گونه زراعي ديگر آن ( oryza glabrima Steud) است كه در جنوب آفريقا كشت مي‌شود(3)

گياه برنج در طول دوره رشد در معرض آسيب عوامل زيان‌آور مختلف قرار مي‌گيرد كه يكي از عمده‌ترين آنها، قارچهاي بيماريزاي گياهي هستند. در بين بيماريهاي قارچي، بلاست بيشترين اهميت اقتصادي را دارد. گرچه تخمين درستي از ميزان كاهش محصول توسط اين بيماري در ايران وجود ندارد، ولي به علت گرايش كشاورزان به كشت ارقام محلي حساس و مساعد بودن شرايط محيطي، همه ساله كشت برنج با كاهش محصول مواجه ميشود(26).

بيماري بلاست كه در اثر قارچPyricularia grisea( Cooke) Sacc ناشي مي‌گردد، به علت گسترش وسيع و بر باد دادن محصول در شرايط مساعد، عموماً به عنوان بيماري اصلي برنج به شمار مي‌رود. اين بيماري تا كنون از 85 كشور جهان گزارش شده است و مي‌توان گفت هر جايي كه برنج بصورت تجاري و وسيع كشت مي‌شود، اين بيماري نيز وجود دارد. (21،19) اگر گياه در مرحله نشائي و يا پنجه زني مورد حمله قرار گيرد، معمولاً از بين مي‌رود.آلودگي گردن خوشه‌ها باعث كاهش محصول مي‌گردد (26). (به عنوان مهمترين بيماري برنج در اكثر كشورهاي برنج‌خيز از جمله ايران بشمار مي‌رود ) به دليل اهميت بيماري بلاست تحقيقات گسترده‌اي براي كنترل آن از جنبه‌هاي مختلف صورت گرفته است، از جمله شناسايي و مصرف انواع قارچكشها، شناسايي منابع ژني مقاومت و تهيه ارقام اصلاح شده مقاوم، معرفي  سيستم‌هاي پيش‌آگاهي و بررسي عوامل اثرگذار در شدت و كاهش بيماري مانند عناصر غذايي، رطوبت، حرارت و....  در سالهاي اخير كنترل بيولوژيكي اين بيماري نيز موضوع تحقيق بسياري از محققين بوده است (20).

 تاريخچه:

بيماري بلاست داراي تاريخچه نسبتاً طولاني است كه به زمان هاي دور يعني نيمه اول قرن هيجدهم ميلادي بر ميگردد(32). سونگ اينگ شين از چين احتمالاً اولين كسي بود كه در سال 1637 در كتاب خود تحت عنوان استفاده از منابع طبيعي راجع به بيماري بلاست بحث كرد و از آن بعنوان سوختگي گياهچه برنج نام برد. درآن زمان  علت اصلي بروز بيماري را گرما يا تب مي‌دانستند و شايد به همين خاطر آنرا بيماري تب برنج (rice fever disease) مي‌ناميده‌اند (26).

هم اكنون بيماري بلاست يكي از گسترش يافته‌ترين بيماري‌هاي گياهي بوده و تا سال 1981 وقوع آن در 85 كشور ثبت شده است. گسترش بيماري چنان است كه در هر جا كه برنج بصورت تجارتي و در مقياس وسيع كشت مي‌شود، بيماري وجود دارد و عامل آن قدرت سازگاري فوق‌العاده‌اي با شرايط محيطي مختلف دارد(32). چنانكه در خاورميانه كه برنج در شرايط حرارتي بالا و رطوبت نسبي پائين به صورت غرقابي كشت ميشود، قارچ عامل بيماري فعال است و گره‌هاي گياه برنج را درست در بالاي سطح آب آلوده مي‌كند، بدون اينكه علائمي از بيماري روي برگها و ساير بافت‌هاي گياه ظاهر شود(26).

در ايران احتمالاً اين بيماري از سالهاي قبل در استانهاي گيلان و مازندران وجود داشته و در اصطلاح محلي به آن پرسوز يا گل خشك گفته مي‌شد ، ولي گزارش مكتوب آن توسط شريف صورت گرفت كه براي اولين بار در سال 1328 از لاهيجان آنرا جمع‌آوري نمود(17و19). هم اكنون اين بيماري در داخل كشور گسترش زيادي دارد و علاوه بر گيلان و مازندران در ساير نقاطي كه كشت و كار برنج در آنها رواج دارد نيز شيوع پيدا كرده است(19) . اين بيماري تا سال 1348 كه خسارت قابل توجهي به محصول برنج در شهرستان رودسر وارد كرد، اهميت چنداني نداشت. علت شيوع اين بيماري در مزارع شمال كشور به احتمال بسيار قوي مربوط به استفاده از كود شيميايي نيتروژنه مي‌باشد كه مصرف  آن از حدود سالهاي 47-1346 در اين مناطق رايج شد. در ايران علاوه بر استان‌هاي شمالي در بسياري از مزارع برنج مناطق ديگر از جمله فارس، خوزستان و كهكيلويه و بوير‌احمد نيز اين بيماري وجود دارد ودر برخي از سالها، با فراهم شدن شرايط مساعد،بصورت  اپيدمي درآمده و سبب كاهش محصول مي‌شود (17،25).

در ايران خسارت بيماري در سال 1353 تقريباً 10 درصد كل محصول برنج گيلان بر‌آورد گرديد.  از آن سال به بعد هر ساله بيماري بلاست سبب كاهش محصول در ارقام محلي مي‌شود و در بعضي از سال‌ها به علت تداوم بارندگي و كاهش دما در تابستان خسارت شديدي در ارقام زود‌رس و زود كاشت، مخصوصاً در شرق گيلان به بار آورده‌است، بطوريكه محصول بعضي مزارع وحتي بعضي روستا‌ها قابل برداشت نبود. در اپيدمي سال 1373 بيماري مذكور در گيلان، بيشترين خسارت در مزارع شهرستان رودسر در زود كشت و درارقام زودرس نظير ارقام رضا‌جو، لاهيجاني‌جو و سنگ‌طارم كه در مرحله ظهور خوشه و خوشه دهي بودند، مشاهده گرديد در حاليكه ارقام اصلاح شده مقاوم مثل سپيدرود و بجار هيچگونه خسارت و علايمي از بيماري نداشتند. بيماري در مزارع قسمت غربي روستاي سوركوه، سوختگي شديد برگها و آلودگي 80 تا 100% خوشه‌ها در رقم رضا‌جو را بدنبال داشت. ميزان آلودگي در مزارع زود كشت روستاي پيش‌بيجار املش 60 تا 70% و در روستاي جورگواسر100%  بود.  خسارت وارده به 200 هكتار از محدوده 400 هكتاري مورد بازديد در اپيدمي سال 1373  در روستاهاي كلان‌كلايه، گرماب‌سرا، كهنه سرا و سيور،  بين 10 تا 100% برآورد گرديد (21).

 عامل بيماري:

قارچ عامل بيماري تحت نام  Pyricularia grisea(Cook) Sacc ناميده مي‌شود. اين قارچ از كلاس قارچهاي ناقص بوده و فرم جنسي قارچ Magnaporthe grisea (Hebert) Barr مي‌باشد(20). ميسليوم قارچ پريكولاريا داراي ديوار عرضي است. كنيديوفرهاي قارچ از ميسليوم منشعب مي‌گردند. روي اين كنيديوفرها، كنيدي‌هاي گلابي شكل كه داراي سه سلول مي‌باشند و به صورت تكي يا گروهي توليد مي‌شوند. كنيدي‌ها بوسيله دنباله‌اي به كنيديوفر چسبيده و از همين محل نيز از آن جدا مي‌گردند. يك تا 20 كنيدي ممكن است روي هر كنيديوفر توليد شود. قسمت پايه كنيديوفر باد كرده زيتوني تا دودي شكل و وقتي به طرف بالا مي‌رود، كم رنگ‌تر مي‌شود. كنيديها از نظر اندازه و شكل قابل تغيير، گلابي شكل تا تخم‌مرغي در پايه پهن و در انتها باريك هستند. كنيديها از سلولهاي پايه و انتهايي و گاه گاهي از سلول وسطي نيز جوانه مي‌زنند. اندازه كنيديهاي قارچ بطور قابل توجهي در ميان ايزوله‌هاو در شرايط محيطي مختلف با هم فرق مي‌كند، ولي بطور كلي در بررسيهاي انجام شده معلوم شده است كه اندازه كنيديهايي كه در درجه حرارت بالا تشكيل مي‌شوند،  بلندتر از آنهايي است كه در درجه حرارت پايين‌تر توليد مي‌شوند. عامل بيماري بلاست روي محيطهاي مصنوعي به سادگي رشد كرده و توليد اسپور مي‌نمايد. رنگ ميسليوم در نژادهاي مختلف قارچ روي محيطهاي مختلف  با هم فرق دارند.بعضي از نژادهاي اين قارچ روي محيطهاي مصنوعي اسپورزائي كمتري داشته و همين‌طور اندازه كنيديها در نژادهاي مختلف روي محطهاي كشت مختلف با هم فرق دارد (19 ، 17 )

علائم بيماري:

بيماري بلاست قادر است به تمام قسمتهاي هوائي بوته برنج حمله نمايد ولي نشانه‌هاي ظاهري آن بيشتر روي برگها قابل رويت است (19).  

قارچ عامل بيماري بلاست به برگ، غلاف برگ، گره‌هاي مياني ساقه، گردن خوشه و خوشه حمله نموده و روي هر يك علايمي را ايجاد مي‌نمايد. شكل و اندازه لكه ها روي برگها با توجه به شرايط محيطي، سن گياه، سن لكه و ميزان مقاومت ميزبان متغير است. روي برگ،  لكه‌ها ابتدا به صورت نقاط آب جذب كرده ظاهر شده و سپس به صورت  لوزي شكل كه در دو انتها نوك‌دار است در مي‌آيند. شكل و رنگ لكه‌ها روي ارقام مختلف وبسته به شرايط آب و هوايي و مقدار كود ازته مصرفي تفاوت دارد. لكه‌هاي موجود روي ارقام حساس و در شرايط مساعد به سرعت بزرگتر شده و به هم متصل مي‌شوند و در نتيجه منتهي به سوختگي برگ مي‌گردند.(شكل 1) (17).

روي گردن خوشه، لكه‌هاي قهوه‌اي رنگ از محل بند گردن شروع شده و در دو طرف پيشروي مي نمايند. در اين حالت كه به بلاست گردن معروف است، گردن خوشه پوسيده شده وخوشه از همين نقطه شكسته وآويزان مي‌شود(شكل 2) و نهايتاً پس از خشك شدن، در مرحله برداشت از ساقه جدا مي‌گردند (17)

خسارت اصلي بيماري بلاست در مرحله خوشه مي‌باشد و  ميزان آن بستگي به زمان آلودگي دارد، به طوريكه اگر آلودگي بلافاصله پس از ظهور خوشه اتفاق افتد، خوشه كاملاً پوك و به رنگ سفيد در مي‌آيد كه مشابه حالت خوشه سفيدي در خسارت نسل دوم كرم ساقه خوار برنج مي باشد، ولي علايم قهوه اي شدن گردن خوشه آن را از خسارت خوشه سفيدي كرم ساقه خوار جدا مي‌كند.  در عوض هر چه آلودگي ديرتر ظاهر شود، خسارت وارده كمتر خواهد بود و دانه‌هاي كمتري پوك مي شوند، ولي اندازه دانه‌ها تا حدود زيادي كوچكتر خواهد شد و حالت شكنندگي دارند كه اين امر در مرحله تبديل منجر به افزايش خرد برنج(نيم دانه) مي‌شود. بنابراين علاوه بر خسارت كمي، خسارت كيفي نيز ايجاد مي‌كند (25).

علايم بيماري روي بند به صورت لكه‌هاي خاكستري مايل به سياه است كه معمولاً روي بندها يا گره هاي پاييني ساقه، نزديك سطح ايست آبي در مزرعه ظاهر مي‌شوند(شكل3  ). بروز شديد اين علايم و پوسيده شدن بندها منجر به ورس يا خوابيدن برنج در مزرعه مي‌شود(17 ).

يكي ديگر از قسمتهاي گياه كه مورد حمله قارچ عامل اين بيماري قرار مي‌گيرد، قسمت يقه برگ است كه collar blast  ناميده مي شود (شكل4). اين علايم نسبت به ديگر علايم ذكر شده خيلي كمتر در مزارع مشاهده‌مي‌گردد(25).

سنبلچه‌ها نيز مورد حمله قارچ عامل بلاست  قرار مي‌گيرند و به سرعت علائم بيماري (5 – 4  روز ) بعد از آلودگي ظاهر مي‌شود و دانه‌هاي سنبلچه را پوك مي‌نمايد. سنبلچه‌هاي آلوده يكي از كانونهاي مهم آلودگي در مرحله خوشه و همچنين براي ارقام ديررس مي‌باشد.(17)

چرخه بيماري:

قارچ عامل بيماري بلاست زمستان را به صورت ميسليوم در بقاياي آلوده برنج و كاه وكلش به سر مي‌برد و يا اينكه به صورت ميسيليوم و اسپور در روي بذور حاصل از مزرعه آلوده وجود دارد. وقتي در بهار آينده شرايط جوي براي رويش ميسيليوم و جوانه زدن اسپور مساعد گرديد، ميسيليوم‌ها در روي كاه وكلش رشد كرده و تشكيل كنيديوفر نموده و روي اين كنيديوفرها،كنيديها تشكيل مي‌شوند. كنيديهاي معلق در هوا روي برگهاي برنج قرار گرفته و در صورتي كه شرايط براي جوانه زدن و نفوذ به داخل ميزبان مساعد باشد، جوانه زده و تشكيل آپروسوريوم مي‌نمايند. سپس از آپروسوريوم لوله تندش بيرون آمده و از طريق روزنه‌ها نيز وارد نبات ميگردد و در صورت حساس بودن ميزبان تعدادي از سلولها از بين رفته و علائم بيماري بصورت لكه‌هاي لوزي شكل روي برگها ظاهر مي‌شود. لكه‌هاي موجود روي برگها در مرحله خوشه مي‌توانند براي آلودگي خوشه‌ها اسپور توليد نمايند. باتوجه به سرعت تكثير اسپورهاي قارچ بلاست، اگر شرايط جوي مناسب ادامه پيدا كند، در يك فاصله زماني كوتاه( تقريباً حدود 15- 10 روز بعد از ظهور بيماري در مزرعه) تراكم بيماري شدت يافته و در ارقام حساس حالت سوختگي بوجود مي‌آورد(17)

توسعه و گسترش بيماري بستگي كامل به عوامل جوي دارد. رطوبت نقش مهمي در گسترش بيماري داشته و كنيديهاي قارچ موقعي روي برگ توليد خواهند شد كه رطوبت نسبي هوا حدود 93% و يا بيشتر باشد و در مواقعي كه رطوبت نسبي هوا كمتر از 88% باشد، اصولاً اسپوري تشكيل نخواهد شد. حرارت نيز مانند رطوبت نقش عمده‌اي در گسترش بيماري دارد. مناسبترين درجه حرارت براي جوانه زدن و تشكيل كنيدي‌ها 28-25 درجه سانتي‌گراد مي‌باشد، مضافاً اينكه اين درجه مناسبترين درجه حرارت براي حمله قارچ به نسوج گياه نيز ذكر گرديده است(17 ، 25 ).

مشاهدات در مزارع شمال ايران نشان مي‌دهد كه علاوه بر حرارت و رطوبت، آفتاب رل مهمي در متوقف كردن فعاليت بيماري دارد، چه آفتاب علاوه بر جلوگيري از تندش كنيدي باعث كم شدن رطوبت و در نتيجه جلوگيري از توسعه بيماري مي‌گردد. بيماري در قسمتي از مزارع كه در سايه و يا پناه درختان قرار گرفته باشند، بشدت گسترش يافته و در نتيجه در روي برگ لكه‌هايي كه حامل تعداد زيادي كنيدي مي‌باشند، تشكيل مي‌گرد (25 ).

در بررسيهاي انجام شده در ژاپن مشخص گرديد كه،  بر روي هر لكه در شرايط آزمايشگاهي هر شب 5000- 4000 كنيدي تشكيل مي‌شود و اين عمل بطور مداوم تا مدت 12-10 روز ادامه دارد. در مواقعي كه بيماري در مزرعه شدت داشته باشد روزانه حدود 15 ميليون كنيدي در سطح يك متر مربع مزرعه مي‌افتند. كنيديها تا ارتفاع 25 متري سطح خاك و بطور افقي تا فاصله 20 كيلومتري مزرعه پرش و قابليت انتقال دارند (19).

باد در شيوع بيماري بلاست نقش متضادي دارد. آسيبهاي وارده به قسمتهاي سطحي گياه توسط بادهاي شديد به نفوذ قارچ عامل بيماري كمك مي‌نمايد. در عوض محرك تبخير در گياه است و در نتيجه سيليسي شدن بافت برگ و تجمع ساير مواد رشدي را در گياه افزايش مي‌دهد كه اين عمل باعث تقويت عكس‌العمل مقاومت گياه مي‌شود. بعلاوه باد شديد عامل مكانيكي رهاسازي كنيدي‌هاي قارچ عامل بيماري مي‌باشد، ولي بادهايي كه كمتر از 5/3 متر در ثانيه باشند،  فقط كنيديفرهاي قارچ عامل بيماري را خشك مي‌كنند. شبنم و بارندگي نيز در تراكم آلودگي مؤثر مي‌باشد. وقتي كه شبنم براي دوره‌هاي طولاني بر روي برگهاي بوته برنج باقي بماند، آلودگي زيادي بر روي برگها ظاهر مي‌گردد. بيماري بلاست معمولاً در مناطق مرتفع‌تر كه شبنم براي مدت طولاني‌تر دوام دارد ( گاهي تا ظهر باقي مي‌ماند) شديدتر بوده، تا مناطق ساحلي كه شبنم براي مدت طولاني باقي نمانده و با نسيم صبحگاهي از بين مي‌رود. باران علاوه بر اينكه درجه حرارت آب شاليزار را پايين آورده،  باعث افزايش رطوبت نيز در طول روز و شب مي‌گردد. ريزش باران با هواي ابري همراه بوده و در نتيجه تعداد سلولهاي سيليسي كاهش يافته و در نتيجه مقاومت برنج نيز كمتر شده و آمادگي بيشتري نسبت به پذيرش بيماري پيدا مي‌كند( 17 ).

نيتروژن يكي از عناصري است كه به منظور افزايش محصول در تغذيه گياه بكار مي‏رود  مصرف زياد نيتروژن بدون توجه به مقدار فسفر و پتاسيم مصرف شده باعث تشديد بيماري بلاست مي‌شود. شدت اثر آن به خاك و شرايط آب و هوايي و روش مصرف بستگي دارد. كودهاي سريع‏الجذب مخصوصا" اگر يكباره  به خاك افزوده شوند، مصرف خيلي دير يا در حرارت پايين درمراحل اوليه رشد و يا در خاكهايي كه ظرفيت نگهداري عناصر غذايي در آنها كم است مانندخاك‌هاي ماسه‏اي يا زمينهاي كم عمق، تاثير بيشتري در توسعه بيماري بلاست دارد.  مصرف بيش از حد نرمال نيتروژن سبب افزايش در جوانه‏زني اسپور، تشكيل آپروسوريوم و اسپوردهي پاتوژن در روي گياه مي‏شود. سيليس به علت اثر مثبتي كه روي رشد برنج دارد يك عنصر ضروري براي آن بشمار مي‏رود. اين عنصر باعث افزايش محصول و جلوگيري از سميت ناشي از آهن منگنز و تسهيل جذب فسـفر توسـط گياه مي‏شود.  برگهاي جوان برنج سيليس كمي دارند و نسبت به بيماري بلاست خيلي حساس هستند برخي محققان در تحقيقات خود به اين نتيجه رسيده‌اند كه بين محتواي سيليس در برگ و ميزان حساسيت به بيماري بلاست همبستگي منفي وجود دارد و هر برگ در مرحله خروج از غلاف بيشترين حساسيت را دارد و با افزايش سن حساسيت آنها كم مي‏شود (25)

خسارت بيماري:

        بيماري بلاست به خاطر پراكندگي وسيع و اثر انهدام كنندگي آن  به عنوان يكي از بيماريهاي مهم و اساسي برنج به حساب مي‌آيد. بوته‌هاي برنج در مراحل پنجه‌زني اغلب به‌طور كامل در اثر اين بيماري از بين

مي‌روند و يا اينكه باعث كوتاه ماندن بوته‌ها و تقليل در تعداد خوشه‌ها مي‌گردد. بيشترين خسارت بيماري در مرحله خوشه كه گاهي باعث نابودي تمام محصول مي‌گردد اتفاق مي‌افتد ( 17 ).هنوز يك شكل واقعي از ميزان خسارت بيماري در دنيا ارائه نشده و ميزان آن در نقاط مختلف  دنيا فرق مي‌كند. در هندوستان طي
 61-1960 خسارت محصول حدود 8/0% كل محصول ثبت شده و در فيليپين، در مناطقي كه همه‌گيري بلاست در آنها وجود داشت، هزاران هكتار از محصول برنج بيش از 50%  خسارت ديده‌اند (32 ). خسارت بيماري در ايران به درستي معلوم نيست و بر اساس گزارشهاي موجود خسارت در بعضي نقاط مانند رودسر بطور متوسط تا 20 % محصول برآورد شده است (19 ). در آزمايشي مشخص شد كه اگر در طول رشد رقم مورد آزمايش (هاشمي) هيچ گونه مبارزه‌اي با اين بيماري نشود، درصد بلاست خوشه  در مرحله برداشت با درصد كاهش محصول همبستگي مثبت دارد.

بيماري بلاست برگي شديد تأثير مستقيم در ميزان رشد برنج دارد و بعد از گلدهي كه عموماً شدت آن كاهش مي‌يابد، برگها (سبزينه) دانه‌ها را پر ميكنند. بنابراين اثر بلاست برگ در محصول دانه برنج غير مستقيم و در يك دوره طولاني است،  لذا  وقتي شدت بيماري بلاست كم باشد و يا اثر آن كوتاه باشد و به عبارتي بيماري  در يك مدت كوتاه ظهور يابد و سپس با محدوديت‌هاي شرايط محيطي نظير كاهش رطوبت  و افزايش درجه حرارت و يا با مصرف قارچكش‌هاي مؤثر متوقف شود، انتظار اين است كه اثر آن در كاهش محصول كمتر باشد، چون گياه در مرحله رشد رويشي  با متوقف شدن بيماري فرصت رشد رويشي مجدد پيدا مي‌كند و سبزينه لازم براي پر كردن دانه‌ را در مرحله بعد از گلدهي خواهد داشت،  هر چند كه ممكن است رسيدن محصول كمي به تأخير بيفتد. اين وضعيت روي ارقام برنج بومي و حساس در شرايط گيلان صادق است و رشد مجدد رويشي با توقف بيماري مخصوصاً در مواقع بلاست برگي شديد بطور معمول در شرايط گيلان ملاحظه مي‌شود. در اين باره، مرحله رشدي گياه در زمان آلودگي به بلاست برگ نيز مهم است،  بطوريكه اگر گياه در مراحل اوليه رشد رويشي آلوده شود و سپس بيماري به هر دليلي متوقف شود، گياه فرصت بيشتري براي رشد مجدد رويشي دارد، اما آلودگي در مراحل آخر پنجه زني و در مرحله شكم، معمولاً فرصتي براي جبران خسارت رشد رويشي باقي نخواهد گذاشت.  بنابراين خسارت به محصول هم جدي‌تر خواهد بود (25).

نژادهای فيزيولوژيک قارچ عامل بيماری بلاست

جدايه های قارچ M. grisea  از نظر بيماریزايی روی ارقام برنج متفاوت بوده و گروههای مختلفی را تشکيل می دهند. بر اساس تعداد زيادی از گزارشها، اين تنوع ممکن است به خاطر توليد مداوم افراد جديد با قدرت بيماريزايی جديد و متفاوت از گذشته باشد. به عبارتی افراد جديد توانايی حمله به ميزبانهايی را دارند که والدين شان قادر به آلوده نمودن آنها نيستند. در طی ساليان گذشته ارقام اصلاح شده مقاوم برنج در مقابل بيماری بلاست چند سال بعد از معرفی شدن حساس شده و مقاومت آنها شکسته شده است. محققين پيدايش نژاد های بيماريزای جديدتر در  جمعيت قارچ را علت اساسی شکسته شدن مقاومتها دانسته‌اند. در صورتی که ارقام اصلاح شده مقاوم قبل از معرفی شدن در مقابل جدايه های نماينده نژاد های موجود در هر منطقه آزمايش نشوند، روند شکسته شدن مقاومت سريعتر خواهد بود. مطالعه روی نژادهای قارچ
M. grisea از اوايل دهه بيستم ميلادی با مشاهده تفاوت جدايه‌ها در بيماریزايی روی يک رقم خاص شروع شد. ساساکی اولين بار اين بيماری را در 1922 مشاهده و گزارش نمود. به هر حال، تعداد  نژادهای شناسايی و گزارش شده از کشورهای مختلف متنوع و زياد بودند و از آنجائيکه طی دهه پنجاه و اوايل دهه شصت ميلادی در هر کشور از گروه خاصی از ارقام  افتراقی برنج برای تشخيص نژادها استفاده می‌کردند ، نژادهای شناخته شده متنوع بوده و قابل مقايسه باهم نبودند. به عبارتی ممکن بود بعضی از نژادها در کشورهای مختلف مشترک باشند ولی با توجه به تفاوت گروه ارقام افتراقی، اثبات آن بسيار مشکل بود. در همين رابطه لاترل و همکاران (1965) بر اين اعتقاد بودند که برای شناسايی نژادها به ارقامی از برنج نياز است که بطور بين‌المللی از آنها استفاده شود و لذا هفده رقم را به عنوان دسته ارقام افتراقی برنج برای شناسايی نژادها پيشنهاد کردند. علاوه برآن جهت يکسان سازی آزمايش‌های شناسايی نژادها محققين ژاپنی و آمريکايی همکاری مشترکی را از سال 1963 برای معرفی دسته مشخصی از ارقام برنج برای استفاده بين‌المللی شروع کردند. آنها طی سه سال تعداد زيادی ازجدايه های جمع آوری شده از ژاپن و آمريکا را روی 39 رقم متمايز آزمايش کردند. اين ارقام در ژاپن، آمريکا، تايوان، پاکستان، چين، هندوستان و فيليپين کشت می شدند. در نهايت هشت رقم Raminad Str.3، Zenith ، Usen ، Np-125 ، Dular ، Kanto 51 ، Sha-tiao-tsao-S و Caloro به عنوان دسته ارقام افتراقی استاندارد بين المللی انتخاب و معرفی شدند. برای نام گذاری نژادها روش  خاصی توسط محققين فوق پيشنهاد گرديد. هشت رقم فوق به عنوان ارقام افتراقی به طور بين المللی از طرف محققين مورد قبول واقع شده و بطور وسيع از آنها در نقاط مختلف دنيا استفاده گرديد و هنوز هم مورد استفاده قرار می گيرند( 25). در ايران تقريباً تمام کارهای انجام شده برای شناسايی نژادهای فيزيولوژيک قارچ M. grisea مبتنی بر استفاده از هشت رقم استانداد بين‌المللي  بوده است (7).

تنوع ژنتيکی عامل بيماري بلاست در شمال ايران کم می باشد که به خودی خود يک استثنا است. دليل تنوع ژنتيکی کم قارچ در شمال ايران را می توان در عوامل زير جستجو نمود. کشت و کار برنج درايران گرچه سابقه طولانی دارد و به بيش از دو هزار سال برمی گردد،  ولی در 40-30 سال اخيروسعت بيشتری پيدا نموده است. در اين چندين سال کشاورزان ترجيح  می دادند از چند رقم محلی و حساس برای کشت استفاده نمايند که يک يا دو مورد آنها کشت غالب را تشکيل می دادند. با توجه به حساس بودن ارقام، وجود ژنهای مقاومت  در آنها يا منتفی بوده و يا تعداد آنها آنقدر کم بود که مقاومتی در مقابل کلونهای موجود بروز نمی کرد. در واقع هيچ فشاری از طرف ميزبان به جمعيت قارچ وارد نمی شد تا به نحوی باعث بروز تغيير در آن گردد. پيدايش ارقام اصلاح شده مقاوم نيز نتوانست نقشی در قضيه داشته باشد، چون به علت عدم استقبال کشاورزان کشت آنها توسعه چندانی پيدا نکرد. علاوه بر وجود ارقام حساس و کشت وسيع آنها، در کشاورزی مدرن از کودهای شميايی بخصوص کودهای ازته برای افزايش راندمان محصول به ميزان زيادی استفاده می شود. اين کودها به نوعی در بالا بردن حساسيت ميزبان تأثيردارند و لذا قارچ نيازی به بروز  تغيير در خود پيدا نمی کند تا با ميزبان سازگاری يابند. علاوه بر اينها کوتاه بودن فصل زراعی نيز يکی از عواملی است که فرصت کافی برای بروز تغييرات ژنتيکی در قارچ را بوجود نمی آورد. گرچه بعلت مساعد بودن تمام شرايط، اپيدمی های کوچکی در بعضی مناطق بروز می کند و اين اپيدمی ها هستند که فشار انتخابی قوی را اعمال کرده، بطوريکه افرادي با شايستگي‌ها و توانايی بيشتر باقی می مانند. درهر صورت بعلت تمام عوامل فوق تنوع ژنتيکی قارچ در شمال ايران در حد پايين نگه داشته شده است. 

توانايی گياه در بروز مقاومت به نوع ژنوتيپ عامل بيماری بستگی دارد. تحقيقات نشان داده اند که  قارچ
M. grisea از نظر ژنتيکی تغييرپذير بوده و با توليد نژادهای بيماريزای جديد قادر است بر مقاومت ميزبان غلبه نمايد و در طی چند سال بعد از بوجود آمدن رقم مقاوم باعث شکسته شدن مقاومت آن گردد. لذا توليد ارقام بدون در نظر گرفتن تغييرپذيری قارچ، باعث شکسته شدن مقاومتها می گردد. به عبارتی مقاومت پايدار وقتی بدست می آيد که لاينهای درحال معرفی در مقابل همه ژنوتيپهای قارچ در هر منطقه آزمايش شده باشند. دانستن تعداد نژادهای فيزيولوژيک و نحوه گسترش آنها در هر منطقه می تواند برای برنامه های اصلاح ارقام برنج جهت بدست آوردن رقم مقاوم در مقابل قارچ عامل بيماری بلاست بسيار مهم باشد.اساساً ايجاد مقاومت پايدار در شرايط محيطی که برای توسعه بيماری بسيار مساعد باشد، در صورتی ممکن است که برنامه های اصلاحی بر پايه درک کاملی از تنوع عامل بيماری در هر منطقه استوار باشد.در آزمايشات انجام گرفته با استفاده از هشت رقم استاندارد بين المللی شش نژاد شناسايی گرديدند که نژاد IC-25 بيشترين جدايه ها را در خود جای داد و نژاد  غالب منطقه را تشکيل داد (26). دو نژاد IA-89 وIA-81 قبلاً گزارش شده بودند (7).

در آزمايشی ديگرتعدادی ارقام ايرانی نيز در کنارارقام استاندارد برای شناسايی نژادهای فيزيولوژيک قارچ در گيلان بکار گرفته شدند. وقتی فقط گروه ارقام استاندارد بعنوان معياری برای تشخيص نژادها بکار رفتند، فقط شش نژاد شناسايی شد وقتی گروه ارقام استاندارد به همراه  ارقام ايرانی ملاک قرار گرفتند، هفت فرم بيماريزايی شناسايی گرديد. در توجيه علت اين پديده می توان گفت که تعدادی از ژن‌های بيماریزايی جدايه های يک نژاد بين المللی که با بکارگيری ارقام افتراقی استاندارد فرصت بروز پيدا نمی‌کنند، وقتی ارقام بيشتری با منبع ژن مقاومت متفاوت بکار می روند،  اين ژنها فرصت بروز پيدا کرده و جدايه های يک نژاد در گروههای جداگانه ای قرار گرفته و در واقع تفکيک می شوند. نتيجه قابل توجه ديگری که از بکارگيری ارقام ايرانی بدست آمد اين است که رقم سنگ طارم که يک رقم محلی محسوب می گردد در مقابل تمام  جدايه های بکاررفته مقاومت نشان داد و بعنوان يک رقم مقاوم به بلاست برگی معرفی گرديد. البته از اين رقم بعنوان يکی از دو والد رقم نعمت در برنامه های اصلاحی استفاده شده است(25).

 روش هاي كنترل بيماري بلاست

بيماري بلاست ‍Pyricularia grisea (Cooke) Sacc. به عنوان مهمترين بيماري برنج در اكثر كشورهاي برنج‌خيز از جمله ايران بشمار مي‌رود و به همين دليل تحقيقات گسترده‌اي براي كنترل آن از جنبه‌هاي مختلف صورت گرفته ‌است،  از جمله تهيه و مصرف انواع قارچكشها، شناسايي منابع ژني مقاومت و تهيه ارقام اصلاح شده مقاوم ، تهيه سيستم‌هاي پيش آگاهي ، بررسي عوامل اثرگذار درشدت و كاهش بيماري همانند عناصر غذايي ، رطوبت و … درسالهاي اخير نيز كنترل بيولوژيكي آن نيز موضوع تحقيق بسياري از محققين بوده‌ است(22).  در مبارزه با بيماري بلاست علاوه بر اينكه بايستي اصول زراعي مناسبي رعايت شود، به علت تنوع ارقام محلي و زودرس يا ديررس بودن آنها و همچنين شرايط جوي گوناگون در سالها و نقاط مختلف مبارزه با اين بيماري بدون در نظر گرفتن عمليات پيش‌آگاهي بسيار مشكل و در بسياري موارد ناموفق بوده است. از طرفي به علت نوسانات قابل توجهي كه از شيوع بيماري و درجه گسترش آن از سالي به سالي، از منطقه‌اي به منطقه‌اي، از رقمي به رقمي، حتي از مزرعه‌اي به مزرعه‌ ديگر وجود دارد. استفاده از قارچ كش‌ها بدون در نظر گرفتن عوامل پيش‌آگاهي مفيد واقع نخواهد شد (17).

 مقاومت به بيماري بلاست در گياه برنج

مقاومت به بيماري در گياه برنج عموماً به توانايي آن به تحمل بيمارگر يا محدودكردن توسعه بيمارگر وابسته است كه شامل مقاومت افقي يا مقاومت مزرعه‌اي، مقاومت عمودي و مقاومت پايدار مي‌باشد. در يك سمينار در مورد مقاومت افقي در برنج در سال 1975 واندرپلانگ  پيشنهاد كرد كه براي تعيين مقاومت افقي (مقاومت مزرعه‌اي) ارقام و لاينهاي برنج را در مزرعه، جايي كه ارقام برنج حساس  هستند در معرض نژادهاي ويرولانس بيمارگر قرار گيرد، مقاومتي كه بدين‌ترتيب كه باقي مي‌ماند به عنوان مقاومت افقي در نظر گرفته شود.  اين ايده منطقي بنظر مي‌رسد اما با توجه به تغييرپذيري بسيار زياد و امكان حضور نژادهاي فيزيولوژيكي در قارچ عامل بيماري، مقاومت افقي تعريف شده توسط واندرپلانك احتمالاً مناسب در سيستم برنج-بلاست (Rice-blast system) نيست و بدنبال سيستم‌هاي ميزبان – پارازيت(host-parasite systems) مختلفي كه در بيماريهاي پژمردگي فوزاريومي گوجه فرنگي و هندوانه، بلايت سيب‌زميني و ديگر محصولات پيدا شد،  بعضي از محققان مقاومت افقي در سيستم برنج-بلاست  را از جنبه‌هاي مختلف مورد مطالعه قرار دادند و نتيجه گرفتند كه نمي‌توان مقاومت ثابتي حتي در تغييرپذيري محدود قارچ عامل بيماري د رگياه برنج تهيه نمود.  بعضي ديگر نيز گزارش كردند كه مقاومت كمي يا مزرعه‌اي به بيماري بلاست را شناسايي كردند و روشهاي اندازه‌گيري در گلخانه و مزرعه را نيز توسعه دادند(24).  همچنين گزارش شد كه مقاومت مزرعه‌اي به بلاست گردن نيز مي‌بايست تعيين شود و اين نوع مقاومت ممكن است حتي در ارقامي كه به بلاست برگ حساس هستند وجود داشته باشد(Rao- 1994).

مقاومت پايدار(Durable resistance) از مقوله‌هايي بود كه مورد توجه محققان زيادي قرار گرفت.  اين نوع مقاومت روي يك جمعيت از بيمارگر در منطقه‌اي مؤثر است كه رقم داراي مقاومت بصورت تجاري در سطح وسيع و براي يك مدت طولاني،  10 سال يا بيشتر، كشت شود.  براي مثال رقم IR36 داراي مقاومت پايدار به بلاست در مناطق مخصوصي مانند كشت آبي(Lowland) در مناطق تروپيك مي‌باشد.  در هر صورت اين نوع مقاومت احتمالا در محيط‌هايي مانند مناطق كشت برنج آپلند كه شرايط براي بيماري بلاست بسيار مستعد است مفيد نخواهد بود(24)

            Ou در سال 1972 نوشته است كه در نيم قرن گذشته،‌ آزمايشات زيادي در كشورهاي مختلف براي تشخيص واريته‌هاي مقاوم به بيماري بلاست انجام شده است(31).  واريته‌هاي مقاوم در برنامه‌هاي دورگ‌گيري با موفقيت محدود استفاده شد و واريته‌هاي جديد براي چندسال مقاوم بودند.  كارهاي انجام شده در فيليپين نيز بيانگر تغيير در واكنش واريته‌ها، مابين مناطق و فصلها بود.  تاريخچه دورگ‌گيري براي مقاومت به بيماريها انباشته از موارد بي‌شماري از شكستن مقاومت واريته‌ها بلافاصله و يا مدتي پس از معرفي آنهاست.  در ژاپن در دو دهه گذشته واريته‌هاي مختلفي به عنوان واريته‌هاي مقاوم معرفي شدند اما پس از چند دوره كشت،‌توسط پاتوژن آلوده شدند.   اين موضوع در ژاپن بطور مكرر تكرار شده است.

در ايران تهيه ارقام مقاوم به دليل اهميت خسارت اين بيماري در شمال كشور از سالهاي گذشته مورد توجه بوده است و ارقام مقاومي مانند خزر، سپيدرود، بجار، نعمت، ندا، آمل 3، فجر، كادوس و درفك معرفي شده‌اند كه در اين فاصله فقط در رقم ندا شكسته شدن مقاومت مشاهده شده است در همه اين ارقام يا منابع ژني مقاومت از ارقام خارجي اخذ شده‌اند و يا اينكه در خود رقم خارجي داشته است و در كشور با آزمايش سازگاري معرفي شده‌اند. در زمينه دست‌يابي به منابع ژني مقاومت در ارقام ايراني از 20 رقم مورد ارزيابي فقط رقم مصباح با تعداد كمي لكه، مقاوم و بقيه ارقام حساس بوده‌اند (6 )،  وپس از آن دريك بررسي 1725 رقم از ارقام بانك ژن گياهي ملي ايران و 157 رقم از ارقام دريافتي از مؤسسه بين‌المللي تحقيقات برنج (ايري) طي سالهاي 81-1379 در يك خزانه بلاست براساس روش استاندارد بين‌المللي كشت و مورد ارزيابي قرار گرفتند (28).

ارزيابي در كرتهايي به ابعاد 2/1×15 متر كه داراي خاك نرم و خشك بود و باكمك ماركر شيارهايي به فواصل 10 ، به عمق تقريبي 5  و به طول 50 سانتي‌متر در مركز كرتها و همچنين دو رديف شيار طولي به اندازه طول كرت در هر دو طرف شيارهاي مركزي و عمود بر آنها ايجاد گرديده و در  هر شيار مركزي حدود 5 گرم بذر از هر يك از ارقام مورد آزمايش كشت گرديد،  بعلاوه به فواصل هر 50 رقم(50 شيار) يك شيار و همچنين شيارهاي طولي با مخلوطي از سه رقم حساس بومي به نامهاي حسن سرايي، بينام و حسني بذرپاشي گرديد. قبل از بذرپاشي در هر كرت به نسبت 50كيلوگرم در هكتار ازت خالص از تركيب اوره و به همين مقدار P₂O₅ به همراه مقدار فراوان كوددامي با خاك مخلوط گرديد.  15 روز پس از بذرپاشي مجدداً همين مقدار كود ازته به صورت سرك در سطح خزانه پاشيده شد.  براي آبياري روزانه دومرتبه يا بيشتر (بسته به شرايط آب و هوايي) در سطح خزانه  بصورت باراني آبپاشي گرديد. بطوري‌كه خاك خزانه هميشه مرطوب بود.هرچند زمان انتخاب شده براي اجراي آزمايش، اسپورهاي طبيعي قارچ عامل بيماري به اندازه كافي در هوا وجود داشت با اين وصف پانزده روز پس از بذرپاشي بتدريج برگ‌هاي برنج آلوده به بيماري بلاست از نقاط مختلف استان گيلان جمع‌آوري و به قطعات 6-3 سانتي‌متري خرد شده، بطور يكنواخت در سطح خزانه پاشيده شد.  بعلاوه از برگهاي آلوده سوسپانسيوني به غلظت يكصدهزار اسپور در هر ميلي‌ليتر تهيه و هنگام غروب روي گياهچه‌ها پاشيده شد. ارزيابي ارقام  مورد آزمايش در مرحله برگي و 30 روز پس از بذرپاشي براساس روش استاندارد بين‌المللي و تيپ آلودگي با درجات صفر تا 9 انجام شد، كه صفر تا 3 به عنوان مقاوم ، 4 الي 5 نيمه مقاوم و 6 الي 9 حساس تلقي شدند. براي ارزيابي واكنش ارقام مقاوم انتخابي در مرحله برگي در مقابل بيماري بلاست در مرحله گردن در سال آخر اجراي آزمايش ارقام انتخابي در گلدان‌هايي كشت شدند و قبل از ظهور خوشه به گلخانه منتقل شدند. براي مايه‌زني در هر رقم پس از ظهور خوشه سوسپانسيوني به غلظت 10⁵×2 كنيديوم از قارچ عامل بيماري در هر ميلي‌ليتر تهيه و 1/0 ميلي‌ليتر از آن به محور گردن هر خوشه تزريق گرديد. 10-7 روز پس از مايه‌زني، براساس علايم ايجاد شده در پايه يا گردن خوشه درجه‌بندي شدند. از 1725 رقم دريافتي از بانك ژن گياهي ملي ايران كه براي اولين بار در خزانه بلاست در مقابل بيماري بلاست در مرحله برگ مورد ارزيابي قرار گرفتند فقط 227 رقم با درجات يك الي سه مقاوم و 36 رقم با درجات چهار الي پنج نيمه مقاوم بودند بقيه ارقام با درجات 6 الي 9 كاملاً حساس بوده‌اند. 

در مرحله دوم ارزيابي، بذر 210 رقم از ارقام مقاوم در مرحله اول در خزانه بلاست رويانده شده و پس از در معرض قرار گرفتن در مقابل آلودگي طبيعي و مايه‌زني با  جدايه‌هاي مختلف جمع‌آوري شده از نقاط مختلف استان گيلان، عكس‌العمل آنها مجدداً درجه‌بندي شدند. نتيجتاً مشخص گرديد 1/68 درصد از آنها كماكان مقاومت خود را حفظ كرده‌اند. 5/23 درصد مقاومت‌شان تنزل يافته و با درجات 4 الي 5 عكس‌العمل نشان داده و بقيه نيز با درجات 6 به بالا كاملاً حساس شدند.

            در مرحله سوم كلاً 177 رقم از ارقام مقاوم و نيمه مقاوم كشت شدند. نتايج اين مرحله گوياي استمرار بيشتر در پايداري مقاومت‌ در ارقام مقاوم مي‌باشد چنانكه از 139 رقم مقاوم تنها 5 رقم مقاومت‌شان كاهش يافت يعني 4/96 درصد از ارقام مقاوم انتخابي همچنان مقاومت‌شان را حفظ كرده‌اند. شش رقم نيز با درجات 6 به بالا حساسيت نشان دادند از بقيه ارقام تعدادي همچنان عكس‌العمل نيمه مقاوم نشان دادند ولي تعدادي ديگر كه قبلاً نيمه مقاوم بودند عكس‌العمل مقاومت نشان دادند كه اين موضوع مي‌تواند ناشي از عكس‌العمل اين ارقام در مقابل نژاد‌هاي خاصي از بيمارگر باشد كه جمعيت‌شان در منطقه كم است. بطور كلي بروز عكس‌العمل‌هاي متفاوت در مقابل بيمارگر در سالهاي مختلف اجراي آزمايش در ارقام مورد آزمايش تقريباً خيلي كم بوده است كه اين موضوع بيانگر محدوديت تعداد نژادهاي بيمارگر در منطقه مي‌باشد. از 157 رقم دريافتي از مؤسسه بين‌المللي تحقيقات برنج (ايري) فقط يك رقم در سال اول ارزيابي، با درجه 7 حساسيت نشان داد بقيه ارقام مقاوم و نيمه مقاوم بودند. در سال دوم بذر 141 رقم از آنها تهيه و مجدداً مورد ارزيابي قرار گرفتند. در اين مرحله 118 رقم با درجات يك الي سه مقاوم و 23 رقم نيمه مقاوم و هيچ رقمي حساسيت شديدي در مقابل بيمارگر نشان ندادند. در مرحله سوم 117 رقم ايري مجدداً براي بار سوم مورد ارزيابي قرار گرفتند كه تنها 7 رقم با درجه چهارنيمه مقاوم بودند. در سال 1381، 160 رقم از بانك ژن گياهي ملي ايران به همراه 88 رقم ار ارقام ايري كه در مرحله برگ مقاوم و يا نيمه مقاوم در مقابل بيماري بلاست بودند به منظور بررسي مقاومت آنها در مقابل بيماري بلاست در مرحله خوشه با تزريق سوسپانسيوني از كنيديومهاي قارچ عامل بيماري مورد ارزيابي قرار گرفتند كه بترتيب 87 و 72 رقم از ارقام بانك ژن گياهي ملي ايران و ارقام ايري مقاومت نشان دادند. استمرار آزمايش براي حصول اطمينان به پايداري مقاومت درارقام برنج در فصول، سالها و مناطق مختلف و در شرايط طبيعي و مزرعه‌اي همچنان مورد توجه و تاكيد بوده و مي‌باشد. در ايري در اولين ارزيابي 8214 واريته از كلكسيون جهاني در خزانه بلاست در هفت آزمايش مكرر مورد ارزيابي مجدد قرار گرفتند كه نتيجتاً تعداد واريته‌هاي مقاوم به 450 واريته كاهش يافت در ادامه اين بررسي اين ارقام در هفت ايستگاه در مناطق مختلف فيليپين چند بار ديگر مورد آزمايش قرار گرفتند. نهايتاً فقط 75 واريته در همه آزمايشات و در همه ايستگاهها مقاومت نشان دادند. بنابراين ارقام مقاوم تعيين شده كه طي سه سال در خزانه بلاست مورد آزمايش قرار گرفته‌اند مي‌بايست داراي مقاومت با ثبات و پايداري در مقابل سوشهاي بيمارگر در گيلان باشند و مي‌توانند به عنوان منابع ژني جديد در برنامه اصلاحي مؤسسه تحقيقات برنج قرار گيرند (24).

بررسی بلاست برنج و روش های کنترل آن - ارائه دهنده پروژه: ابراهیم دودابی نژاد

پيش‌آگاهي بلاست

 پيش‌آگاهي يك بيماري مي‌تواند به زارع كمك كند كه در مورد استفاده يا عدم استفاده از روش‌هاي مديريت آن بيماري تصميم‌گيري نمايد و در صورت استفاده از روش‌هاي مديريتي، زمان كاربرد صحيح آن روش‌ها را تعيين نمايد. تحقيقات زيادي به منظور پيش‌آگاهي بيماري بلاست برنج در كشورهاي مختلف انجام شده است كه در غالب اين مطالعات از عواملي نظير خصوصيات گياه ميزبان، تعداد اسپورهاي شكار شده يا فاكتورهاي آب و هوايي خصوصاً رطوبت، حرارت، بارندگي و ساعات آفتابي براي پيش‌آگاهي بيماري استفاده شده است (27).

اولين مطالعات در ارتباط با پيش‌آگاهي بلاست در ايران در سال 1359 صورت گرفت. در اين مطالعه وضعيت بيماري بلاست براساس متوسط درجه حرارت، رطوبت نسبي هوا، شبنم و بارندگي در ارقام محلي مختلف مورد بررسي قرار گرفت.  همچنين در مطالعه انجام‌شده توسط ايشان، ارتباط بين ميزان بيماري با تعداد اسپور شكارشده با تله اسپورگيري مشخص گرديد. در اين تحقيق مشخص گرديد كه:

-    قبل از مشاهده علائم بيماري، با مساعد شدن شرايط جوي، مجموع درجه حرارت در طي مدت 7 تا 8 روز به حدود 140 درجه سانتي‌گراد مي‌رسد. 

-    در طول مدت رشد گياه با توجه به متوسط درجه حرارت، رطوبت نسبي هوا و تعداد اسپور قارچ عامل بيماري در هوا مي‌توان چگونگي پيشرفت بيماري را مشخص ساخت. 

-    بروز بيماري بلاست و افزايش ميزان آلودگي با بالارفتن حداكثر رطوبت نسبي هوا (بيش از 90 درصد) همراه است و نكته مهم در اين مورد مجموع ساعات رطوبت نسبي بيش از 90 درصد در طي چند روز متوالي مي‌باشد.

-        بالارفتن رطوبت نسبي هوا موجب افزايش تعداد اسپور در هوا مي‌گردد.

-    تغييرات درجه حرارت، پيوسته موجب نوسان تعداد اسپور موجود در هوا مي‌گردد، طوري كه با پائين‌رفتن متوسط درجه حرارت تعداد اسپور بيشتري شمارش مي‌شود.

-    تغييرات ميزان آلودگي همچنين با ابري‌بودن هوا و بارندگي در ارتباط است. در روزهاي قبل از بارندگي و ابري بودن هوا پيشرفت بيماري كند مي‌باشد، ولي بعد از بارندگي و در صورت كافي بودن ميزان اسپور بر ميزان آلودگي بلاست برگ به طور قابل ملاحظه‌اي افزوده مي‌گردد.  

اسماعيل‌پور همچنين عواملي نظيرتاريخ نشاكاري، تراكم كشت، نوع رقم و زمان ظهور بيماري در مزرعه را در شدت بيماري بلاست مؤثر دانست. همچنين ايشان ذكر كرد كه آلودگي محل اتصال برگ به دمبرگ و ميزان آلودگي بلاست برگ در شدت آلودگي گردن خوشه مؤثر است (1).

ايزديار در مطالعه‌اي در سال 1359 از ميزان رشد ميسليوم قارچ عامل بلاست در سلولهاي غلاف‌‌برگ به عنوان معياري براي پيش‌آگاهي بيماري استفاده كرد. در اين بررسي به منظور تعيين رابطه توسعه بيماري بلاست در مزرعه و رشد ميسليوم قارچ بلاست درداخل سلولهاي غلاف برگ، به كمك روش مايه زني در غلاف جمعاً يازده رقم از برنج‌هاي محلي به دو طريق زير مورد بررسي قرار گرفتند:

1-  از چهار رقم برنج كه در يك مزرعه نمونه كاشته شده بود، به فواصل يك هفته از آغاز پنجه زني نبات لغايت مرحله تورم خوشه نمونه‌برداري شد و نمونه‌ها مورد آزمايش قرار گرفتند. در اين بررسي معلوم شد كه واكنش ارقام آزمايش شده نسبت به سوش شايع در منطقه با هم متفاوت است و از طرف ديگر هر رقم در مراحل مختلف رويش نسبت به قارچ مذكور حساسيت متفاوتي را نشان مي‌دهد.

2-  از مزارع و ارقام مختلف برنج در استان گيلان كه درجات آلودگي در آنها متفاوت بود، به طور تصادفي نمونه‌برداري و با قارچ بلاست همان مزرعه آزمايش شد و به طور كلي معلوم گرديد كه بين درجه رشد ميسليوم در داخل سلول‌هاي غلاف برگ و توسعه بيماري در مزرعه رابطه مستقيمي وجود دارد و به عبارت ديگر در هر نمونه‌اي كه درجه رشد ميسليوم در داخل سلول غلاف برگ بالاترين درجه را نشان داده بود، بيماري در آن مزرعه گسترش و شدت بيشتري داشت.

ايشان در ادامه تحقيقات خود (1372)، فرمول Y=19. 33X – 9.8 را براي اين ارتباط معرفي نمود كه در آن  X درجه رشد ميسليوم در سلول غلاف برگ وY  درصد برگهاي آلوده مي باشد(10).

ايزديار در مطالعه ديگري (1362) رابطه بين شرايط جوي و توسعه بيماري بلاست برگ و خوشه در ارقام مختلف برنج در استان گيلان را مورد مطالعه قرار داد(11). در اين مطالعه سعي گرديد اثر عوامل جوي روي شدت بيماري بلاست با نصب دستگاههاي ترموهيگروگراف و باران‌نگار در مزرعه نمونه‌اي كه به همين منظور تهيه شده بود، مورد مطالعه قرار گيرد. در اين بررسي معلوم شد كه ايجاد و گسترش بيماري بلاست در مزرعه رابطه مستقيمي با  فراهم‌شدن شرايط جوي مطلوب در مراحل حساس اين ارقام دارد و همچنين تا زماني كه حداقل درجه حرارت در شب بيش از 5/19 درجه سانتي‌گراد  نباشد، آلودگي انجام نمي‌گيرد.

ايزديار در تحقيقي ديگر (1372) با تعيين رابطه بين تراكم اسپور در هوا و تراكم بلاست برگ و درصد بلاست خوشه در ارقام مختلف برنج در مزرعه، فرمولهايي را براي پيش‌آگهي شدت بيماري و تعيين زمان دقيق مبارزه تهيه كرد. بدين منظور ارقام مختلف بينام، دم زرد، حسن‌سرائي، سالاري و موسي‌طارم در تاريخهايي به فواصل 7-6 روز در خزانه كاشته شده و با همين فاصله به زمين اصلي منتقل گرديدند. براي بررسي تراكم اسپور در هوا يك دستگاه اسپورتراپ در كنار مزرعه نصب گرديد و تعداد  اسپور شكار شده در 24 ساعت شمارش گرديد. تراكم بلاست برگ به فواصل 5 روز بعد از ظهور اولين علائم بيماري در مزرعه با شمارش لكه‌هاي موجود در روي 50 پنجه يادداشت برداري شد. درصد بلاست خوشه نيز در زمان برداشت محاسبه گرديد(14).

همچنين در مطالعه ديگري كه توسط ايشان صورت گرفت، رابطه بين تعداد روزهاي بعد از نشاءكاري تا آغاز ظهور علائم بيماري در مزرعه با لگاريتم حداكثر بلاست برگ با كشت ارقام مختلف در چهار تاريخ به فواصل 7-6 روز درطول 6 سال و تعيين زمان اولين آلودگي در مزرعه و همچنين شدت بلاست برگ مطالعه شد و معلوم گرديد كه هر چقدر فاصله بين زمان نشاء تا ظهور اولين علائم بيماري بلاست برگ در مزرعه طولاني‌تر باشد شدت بيماري كمتر است. به عبارت ديگر بين فاصله آلودگي بعد از نشاء با تراكم بلاست برگ همبستگي منفي وجود دارد(12). رابطه بين ميانگين حداقل درجه حرارت از زمان نشاء تا آغاز ظهور علائم بيماري در مزرعه با  شدت بلاست برگ نيز توسط ايشان مورد بررسي قرار گرفت و در اين بررسي معلوم گرديد كه هرچقدر ميانگين حداقل درجه حرارت از زمان نشاء تا ظهور اولين علائم بيماري در مزرعه بيشترباشد، شدت بلاست برگ زيادتر خواهد بود و از طرف ديگر فاصله بين زمان نشاء و آغاز ظهور لكه‌هاي بلاست در مزرعه كوتاه‌تر مي‌گردد. به عبارت ديگر بين ميانگين حداقل درجه حرارت و فاصله زمان نشاء تا زمان آغاز آلودگي در مزرعه همبستگي منفي وجود دارد(13).

اخوت نيز به منظور بررسي اثر سنين مختلف رشدي بوته هاي برنج روي شدت بيماري بلاست، مطالعه‌اي را بدين صورت انجام داد:

در چندين سال از اوايل فروردين، خزانه‌گيري به فاصله ده روز يكبار با خيساندن بذر رقم حساس مهر يا موسي طارم انجام شد. نشاء‌كاري هر هفته يك بار در ايستگاه تحقيقات برنج آمل صورت گرفت. براي هر تاريخ نشاء از طرح بلوكهاي كامل تصادفي استفاده گرديد. دو هفته پس از نشاء‌كاري، تعداد لكه‌هاي ايجاد شده روي 100 برگ شمارش شدند و هر 15 روز يكبار شمارش لكه‌ها روي برگها تكرار گرديد. شرايط جوي، وضعيت اسپورزايي، تعداد اسپور قارچ عامل بيماري و چگونگي گسترش بيماري در تمامي ايام شبانه روز فصل زراعي مورد بررسي قرار گرفتند(2).

بررسي‌هاي انجام شده مربوط به تعداد لكه و شدت بيماري بلاست برگ نشان داد كه آلودگي‌ها در اواسط تير ماه و اوايل مرداد كه مصادف با مرحله پنجه‌زني بوته‌هاي برنج است، بيشتر مي‌باشد. تعيين همبستگي بين تعداد لكه و سن بوته‌ها نشان داد كه هر چه سن بوته‌ها (X) افزايش يابد، تعداد لكه روي برگها(Y) و شدت بيماري كاهش مي‌يابد.  در اين ارتباط معادله  X 4/0-288/4=LogY  با 917/0- = r  بدست آمد(27). 

 مبارزه بيولوژيك

         كنترل بيولوژيك بيماريهاي گياهي از سالهاي دور مورد توجه محققان بوده است. بيكروكوك
(Baker& Cook-1974) واژه كنترل بيولوژيك را چنين تعريف كرده‌اند : « كاهش جمعيت يك پاتوژن يا فعاليت بيماريزايي آن بوسيله يك يا چند ميكرو ارگانيزم بجز انسان ». اين تعريف باندازه كافي گسترده بوده و استراتژيهاي جديد كنترل زيستي كه روي جمعيت آنان مؤثرند را نيز شامل مي‌شود اين استراتژي جديد شامل استفاده از ريزوباكتريهاي  افزايش دهنده رشد گياه، مقاومت القايي، سيستمهاي زيستي  كه پاتوژن را از ميزبان محروم مي‌كند و نهايتاً  گياهان تراريخته (transgenic) است. مصرف آفت‌كشها به عنوان آلاينده‌هاي محيطي توجه زيادي را به خود جلب نموده است، مسلم است كه آفت‌كشها نقش مهمي در پايداري توليد غذا و نگهداري آن دارند ولي اين مزايا خطراتي نيز به همراه دارند. تاكاجي ويوجي
(Takagi & Uegi- 1997) اين خطرات را به دو نوع تقسيم كردند :

1-  خطرات انساني كه دراثر سميت آنها بوجود مي‌آيد شامل سميت حاد، مزمن ، سرطان زايي، تغييرات شگفت‌آورو هولناك مادرزادي و تجمع بيولوژيكي .

2- خطرات زيست محيطي كه به دوگروه تقسيم مي‌شود :

 الف  – آلودگيها، كه شامل آلودگيهاي رودخانه‌ها، آبهاي زيرزميني، آبهاي آشاميدني، هوا و خاك مي‌شود. ب – نابودي اكوسيستم كه شامل نابودي حيات وحش و افزايش در مقاومت مي‌شود.

به همين دليل در سالهاي اخير تحقيقات گسترده‌اي در جهت كنترل بيولوژيك آفات ، بيماريها و علفهاي هرز صورت گرفته است. برنج نيز در زمره محصولاتي است كه تحقيقات خوبي در زمينه كنترل بيولوژيك بيماريهاي آن از جمله بيماريهاي پوسيدگي طوقه، لكه‌قهوه‌اي، بلاست و سوختگي غلاف صورت گرفته است. درموسسه بين‌المللي تحقيقات برنج تعداد زيادي از باكتريهاي اكوسيستم برنج جداسازي شدند و باكتريهايي كه در محيط كشت از رشد ميسيليومي قارچ‌هاي عامل بيماري بلاست، سوختگي غلاف و پوسيدگي طوقه جلوگيري كردند در گلخانه و مزرعه نيز  روي اين بيماريها مورد آزمايش قرارگرفتند و در ارتباط با بيماري بلاست بذور رقم Cheong – Cheong – byeبا 16 جدايه تيمار شد و در سيني‌هاي نشا كشت گرديد. 20 روز بعد سوسپانسيون اسپور قارچ عامل بيماري بلاست روي نشاها پاشيده شدند و 10 روز بعد لكه‌هاي بلاست  در تيمارها شمارش گرديدند. تعدادي از باكتريهاي مورد آزمايش تاثيري در كاهش بيماري نداشتند ولي سه جدايه بترتيب با 2/53 ، 4/65 و 7/66 لكه در مقايسه با شاهد با 2/244 لكه ، سبب كاهش بيماري شدند(28) . در تحقيق ديگري 400 جدايه باكتري از مزارع برنج ايري (IRRI) جداسازي و در آزمايشگاه براساس خاصيت آنتاگونيزمي در مقابل قارچهاي عامل بلاست و سوختگي غلاف اسكرين(غربالگري) گرديدند.  دراين بررسي 9 باكتري شامل سه جدايه از Pseudomonas fluorescens ، 5 جدايه از Bacillus spp ويك جدايه از Enterobacter شناسايي شدند. اين باكتريها سپس در مزرعه نيز ارزيابي گرديدند و تيمار كردن بذور با اسپري كردن آنها در مرحله برگي منجر به كاهش 50 الي 73 درصد از شدت بيماري بلاست در مرحله برگي دررقم IR 50 و 34 الي 80 درصد در واريته C-22 در شرايط lowland و 47 الي 57 درصد در واريته UPLRI-5 در شرايط upland شد و در ادامه اين بررسي از يك استراينPseudomonas دوآنتي‌بيوتيك AB1 و AB2 جدا شدند كه در غلظت 1ppm از جوانه زدن اسپورهايP.oryzae جلوگيري‌نمودند و همچنين 92-90 درصد شدت بيماري بلاست برگ را كاهش دادند.

در بررسي ديگر در فيليپين لكه‌هاي بلاست از دو منطقه در مراحل نشاء و پنجه زني جمع‌آوري و سري‌هاي مختلفي‌از محلول حاصل از شستن لكه‌ها كشت گرديدند.  اثر آنتي‌بيوزيس باكتريهاي جداشده در مقابل P.grisea مورد بررسي قرار گرفت  بطوركلي در دومنطقه اختلافي از نظر جنس‌هاي باكتريها وجود نداشت ولي جمعيت Bacillus ها در مرحله پنجه‌زني بيشتر از مرحله نشا و همچنين در لكه‌هاي بزرگتر و يا كهنه‌بيشتر از لكه‌هاي كوچك و جوان بود در عوض جمعيت Pseudomonas در مرحله نشا بيشتر بود بعلاوه بيشتر آنها برخلاف باسيلوسها همراه نمونه‌هاي برگ سالم بودند همچنين مشخص گرديد كه اكثر باكتريهاي آنتاگونيست همراه لكه‌ها بودند و نمونه‌هاي برگ سالم كمترين باكتريهاي آنتاگونيست را داشتند.  در مطالعه ديگري توانايي 20 ميكروارگانيزم آنتاگونيست در جلوگيري از توسعه بيماري بلاست برگ مورد آزمايش مقدماتي قرارگرفت و مشخص گرديد كه Chaetomium globosum ,Micromonospora sp., Trichoderma harzianum بترتيب موثرترين آنها بودند.(22) در آزمايشي در گيلان(موسسه تحقيقات برنج كشور) از نقاط مختلف استان  145 نمونه ريشه گياه برنج(همراه با خاك چسبيده به آن )، ‌برگ‌هاي آلوده به  بيماري بلاست، گردن خوشه‌هاي آلوده به بيماري بلاست(Neck blast) و بذر، جمع‌آوري شده و به آزمايشگاه منتقل گرديدند. نمونه‌هاي جمع‌آوري شده در محيط كشت‌هاي مصنوعي كشت ونمونه‌هايي  جداسازي شده‌اند.

 ارزيابي خاصيت آنتاگونيستي ميكروارگانيزم‌ها

1-آزمايش آنتي بيوزيس (Antibiosis) : Bacterial ring ،.براي اين‌كار باكتري را بصورت چمن در محيط كشتPDA رشد داده، سپس لبه لوله آزمايش با قطر دهانه cm 5/3 را به آرامي روي باكتري قرارداده، پس از آن  باكتريهاي چسبيده به لبه لوله آزمايش را  بصورت حلقه كاملي در مركز تشتك پتري ديگري كشت داده‌شدند. بلافاصله قرصي از كشت 5 روزه قارچ عامل بيماري درمركز حلقه باكتري قرارداده‌شد (هر جدايه باكتري  در 3 تكرار).   پتري‌هاي كشت شده را در انكوباتور با حرارت 28-26 درجه سانتيگراد و نور متناوب فلورسنت 12 ساعته قرارداده، 3 و 5 روز بعد قطر  رويشي پاتوژن اندازه‌گيري شد.
در روش ديگر  قرصي از كشت 5 روزه پاتوژن و هريك از قارچ‌هاي جداسازي شده را به فاصله cm5 از يكديگر روي محيط غذايي PDA كشت داده،  در شرايط فوق‌الاشاره در انكوباتور نگهداري و با فاصله 3  روز شعاع رشد پاتوژن اندازه‌گيري شد. براي همه باكتريها و قارچها ميانگين رشد پاتوژن در سه تكرار اندازه‌گيري و درصد بازداري از رشد  رويشي بيمارگر به كمك فرمول ابوت (Abbott, 1925)
تعيين گرديد.

2-جوانه‌زني كنيديومهاي بيمارگر :  يك لوپ از سوسپانسيون كدر هر يك از باكتري‌هاي آنتاگونيست انتخابي را در 20 ميلي‌ليتر محيط غذايي مايع PS در ارلن 50 ميلي‌ليتري بطور جداگانه كشت داده، 24 ساعت روي شيكر با 180 دور در دقيقه در محيط آزمايشگاه قرار داده شد.  سپس سوسپانسيوني به نسبت يك به يك از كشت  مايع باكتري و كنيديومهاي قارچ عامل بيماري (يكصدهزار كنيديوم در ميلي‌ليتر) در ظرف شيشه ريخته و پس از 4 ساعت نگهداري در دماي 28-26 درجه سانتيگراد، تعداد كنيديومهاي جوانه‌زده در هر تيمار و شاهد در 400 كنيديوم شمارش گرديد و به كمك فرمول ابوت (Abbott, 1925) درصد بازداري از جوانه‌زني كنيديومهاي بيمارگر تعيين گرديد.

3-بلاست برگ : گلدانهاي پلاستيكي به ابعاد 16×10 سانتي‌متر  را با خاك مزرعه پر كرده،  بذور برنج رقم بينام (حساس) جوانه‌دار شده را در آنها كشت نموده در گلخانه قرار داده شد.  همزمان قارچ عامل بيماري بلاست (P.grisea)  روي محيط غذايي PA (Prune Agar) به منظور تهيه كنيديوم كافي كشت گرديد،  قبل از مايه زني 16 جدايه باكتري انتخابي را بطور جداگانه  در ارلن‌‌هاي 50  ميلي‌ليتري حاوي 30 ميلي‌ليتر محيط غذايي PS (عصاره سيب‌زميني و ساكاروز) كشت داده، 24 ساعت روي شيكر با 180 دور در دقيقه در شرايط آزمايشگاه قرار داده،  سپس سوسپانسيوني به نسبت 300 هزار كنيديوم در هر ميلي‌ليتر از بيمارگر در محلول 5/2 درصد ژلاتين تهيه گرديد.  10 ميلي‌ليتر از اين سوسپانسيون را با 20 ميلي‌ليتر از محلول هر جدايه باكتري مخلوط نموده و روي نشاهاي چهاربرگه در چهار گلدان محلول‌پاشي گرديد.  تيمار شاهد فقط با سوسپانسيون كنيديوم بيمارگر مايه‌زني گرديد.  در هر گلدان چهار قطعه چوب نازك فرو نموده و روي هر كدام از آنها يك كيسه پلاستيكي شفاف به منظور حفظ و تأمين رطوبت قرار داده شد.  گلدانها را به اتاقك گلخانه كه با گوني پوشانيده شده و مجهز به دستگاه رطوبت‌ساز بود منتقل گرديد.  10 و 15 روز بعد تعداد لكه‌هاي بلاست در كليه بوته‌‌ها و در تمام تيمارها  شمارش گرديد.  داده‌ها پس از تبديل  به كمك نرم‌افزار MSTATC و براساس طرح كاملاً تصادفي مورد تجزيه و تحليل آماري قرار گرفتند.

كلاً اثر آنتاگونيستي 132 جدايه قارچ و باكتري روي رشد رويشي بيمارگر(Pyricularia grisea) در محيط غذايي PDA مورد بررسي قرار گرفت.

1- قارچ‌ها :  در يك آزمايش اثر 43 جدايه قارچ روي رشد رويشي بيمارگر انجام شد كه ميزان آن بين صفر تا 7/72 درصد متغير است. مشاهده شد كه اكثر قارچهاي مورد ارزيابي (%8/55) در گروهي قرار دارند كه تأثيرشان در جلوگيري از رشد رويشي بيمارگر بين صفر تا 10 درصد است.  در واقع به جز جدايه F.161 با توان بازداري% 7/72 ، تأثير بقيه آنها كمتر از 50 درصد بود. تأثير بعضي گونه‌ها شناخته شده  مانند Trichoderma harzianum (جدايه‌هاي F.42 و F.24) و Gliocladium virens (جدايه F.64)  نيز در حد قابل توجهي نبود.

2- باكتري‌ها :  تأثير 89 جدايه باكتري در جلوگيري از رشد رويشي بيمارگر به فواصل 3 و 5 روز نشان مي‌دهد كه باكتريها از اين نظر خيلي  بهتر از قارچها بوده‌اند.  هر چند انتخاب و جداسازي باكتريها از نمونه‌هاي كشت شده هدف‌دار صورت گرفته است و به همين دليل همه باكتريهايي كه در آزمايش آنتي‌بيوزيس مورد بررسي قرار گرفتند توانايي بازداري از رشد رويشي قارچ عامل بيماري بلاست را داشته‌اند باكتريهاي آنتاگونيست علاوه بر توقف رشد رويشي بيمارگر، سبب تغييرات مرفولوژيك نيز در آن مي‌گردند.  تغييرات عمده حاصل از باكتريهاي جنس باسيلوس، توپي شدن نوك ميسيليوم‌ها است كه گاهي چيزي شبيه خوشه‌هاي انگور را تداعي مي كند در حاليكه علايم بارز تأثير گونه‌هاي جنس پسودوموناس قطعه‌قطعه‌ شدن محتويات داخل ميسليوم‌هاي انتهايي است.  بعلاوه رشد ميسيليوم‌ها بصورت هوايي و به رنگ سفيد از قرص بيمارگر كه در مركز حلقه باكتري قرار گرفته بود در مقابل بسياري از باكتريهاي آنتاگونيست نبز مشاهده گرديد كه بعضاً بصورت توده سفيد رنگي در مي‌آيند.

3- شناسايي باكتريهاي آنتاگونيست :  30 جدايه باكتري كه در آزمايش آنتي‌بيوزيس قادر به كاهش رشد رويشي بيمارگر به ميزان بيش از 90 درصد بودند انتخاب و به روشهاي استاندارد بيوشيميايي شناسايي شدند.  از اين باكتريها 9 جدايه Bacillus circulans ، 8 جدايه B. megaterium ، 4 جدايه B. subtilis،
2 جدايه B.sp. ، 4 جدايه Pseudomonas fluorescens و 3 جدايه P.aeruginosa تشخيص داده شدند

4- اثر باكتريهاي آنتاگونيست در كنترل بيماري بلاست در گلخانه :  ده روز پس از پاشيدن مخلوط سوسپانسيون‌هاي 16 جدايه باكتري با كنيديومهاي بيمارگر روي نشاهاي برنج رقم بينام(حساس)، تعداد لكه‌هاي بلاست شمارش و براساس ميانگين تعداد لكه در يك نشاء  مورد مقايسه قرار گرفتند.  جداول تجزيه واريانس اين ارزيابي پس از 10 و 15 روز نشان داد كه اثر تيمارها در يك درصد معني‌دار است بنابراين باكتريهاي مورد آزمايش در كاهش بيماري مؤثر بوده‌اند.   در اين فاصله باكتريهاي
Bacillus circulans به شماره‌هاي B.125 ، B.11 و  B.28 و Pseudomonas fluorescens  به شماره B.117 و B.subtilis به شماره B.145 با كمترين آلودگي در گروه اول قرار دارند(10)

در آزمايشي ‌ديگردوازده جدايه باكتري شاملBacillus circulans، B. subtilis، B. megaterium، Bacillus sp.  و Pseudomonas fluorescens ، انتخاب شده براساس خاصيت آنتاگونيستي آنها در مقابل قارچ عامل بيماري بلاست (Pyricularia grisea) جهت كنترل بيماري در شرايط مزرعه  در رقم برنج بينام(حساس)  براساس طرح بلوكهاي كامل تصادفي در چهار تكرار به مدت دو سال مورد ارزيابي قرار گرفتند. بوته‌هاي برنج طي مراحل: همزمان با شروع بيماري بلاست در مزرعه، 15 روز بعد از آن و در مرحله خوشه با سوسپانسيوني از كشت 48 ساعته هر باكتري در محلول كاربوكسي متيل سلولز ( يك گرم در ليتر) باكتري پاشي شدند. براي ارزيابي در مرحله برگ، 15 روز پس از هر بار باكتري‌پاشي درصد آلودگي سطح هر برگ (DLA%) در 25 پنجه و در مرحله خوشه، درصد بلاست خوشه در مرحله رسيدن در شرايط آلودگي طبيعي تعيين شدند. نتايج نشان داد كه تعدادي از باكتريها در مقايسه با شاهد بطور معني‌داري سبب كاهش بيماري شدند اما تأثيرشان هميشه كمتر از تيمار قارچكش بوده است. باكتري B. circulans B. 17B كه از قارچ عامل بيماري جداسازي شده بود پايداري بيشتري در كنترل بيماري بلاست در مراحل برگ و خوشه در طول بررسي در مقايسه با بقيه باكتري‌ها داشته است(23)

 اجراي آزمايش در مزرعه :

براي اجراي اين آزمايش از رقم برنج بومي بينام  كه حساس به بيماري بلاست است استفاده گرديد. در اوايل ارديبهشت مقداري از بذر رقم مذكور را پس از جوانه‌دار نمودن، در بستر خزانه پاشيده و به مدت 15 الي 20 روز روي آن با پوشش پلاستيكي پوشانده شد. حدود 30 روز پس از بذر پاشي نشاها آماده نشاكاري گرديد. زمين محل آزمايش پس از آماده‌سازي براساس طرح بلوكهاي كامل تصادفي و با چهار تكرار كرت‌بندي گرديد. اندازه كرتها 2×2 متر و فاصله هر كرت از كرتهاي مجاور يك‌متر در نظر گرفته شد. همه كرتها همزمان در يك روز (دهم خرداد) به فواصل 20×20 سانتي‌متر نشاكاري شدند. در فواصل بين كرتها مخلوطي از سه رقم بومي حساس(بينام، حسني و علي‌كاظمي) در دو رديف و به فواصل 10 سانتي‌متر به عنوان پخش كننده(Spreader) عامل بيماري نشاكاري شدند.

مبارزه با علفهاي هرز در مرتبه اول با علف‌كش بنتيوكارب به نسبت 5 ليتر در هكتار و در مرتبه دوم بصورت وجين دستي انجام شد. كود مصرف شده شامل سوپر فسفات تريپل به نسبت 50 كيلوگرم در هكتار كه قبل از نشاكاري در مزرعه پاشيده شد و كود اوره به نسبت 150 كيلوگرم در هكتار كه طي 3 مرحله(هر بار به نسبت 50 كيلوگرم در هكتار) قبل از نشاكاري، 20 و 40 روز پس از نشاكاري در سطح مزرعه بصورت يكنواخت پاشيده شد. براي مبارزه با كرم ساقه‌خوار برنج از ديازينون گرانول %10 به نسبت 15 كيلوگرم در هكتار براي هر دو نسل آن استفاده شد.

1-    كشت و تكثير باكتريها : همه باكتريها در ارلنهاي حاوي 40 و 80 ميلي‌ليتر محيط غذايــي
 Nutrient glucose broth (عصاره گوشت 3 گرم، پپتون 5 گرم، گلوكز 5/2 گرم و آب مقطر يك ليتر) كشت شده و به مدت 48 ساعت روي شيكر(100 دور در دقيقه) در دماي اتاق نگهداري شدند.

2-    باكتري پاشي در مزرعه : باكتري پاشي روي گياه برنج در سه مرحله به ترتيب دو مرتبه در مرحله برگ، همزمان با شروع آلودگي طبيعي بيماري بلاست در منطقه و 15 روز پس از آن و يك مرتبه در مرحله پس از ظهور تمام خوشه‌ها به هنگام عصر انجام شد. در مرحله اول 40 ميلي‌ليتر از محيط كشت حاوي هر باكتري را با 960 ميلي‌ليتر محلول يك گرم در ليتر كاربوكسي متيل سلولز مخلوط كرده و 250 ميلي‌ليتر از سوسپانسيون بدست آمده در سطح برگهاي گياه در يك تكرار پاشيده شد. در مراحل دوم و سوم به علت رشد بيشتر گياه500 ميلي‌ليتر از سوسپانسيون هر باكتري به كمك افشانه‌هاي يك ليتري براي باكتري پاشي در هر تكرار پاشيده شد.

نمونه‌برداري : براي نمونه‌برداري در مرحله برگ 15 روز پس از هر بار باكتري پاشي، در هر كرت 25 پنجه از 25 بوته كف برشده و درصد آلودگي سطح همه برگها(DLA%) تعيين شدند(Anonymous-1993). در مرحله خوشه پس از رسيدن، 10 بوته كف‌بر شده و درصد خوشه‌ها  و گروه‌هاي مياني آلوده تعيين گرديد.
 براي اندازه‌گيري ميزان عملكرد، كليه بوته‌ها در سطح يك مترمربع از مركز هر كرت برداشت شده، پس از خرمنكوبي، محصول آن توزين گرديد.

 نتايج و بحث

اثر باكتريهاي آنتاگونيست روي بيماري بلاست در هر سه مرحله ارزيابي در هر دو سال معني‌دار بوده است. در مرحله اول ارزيابي در سال 1381 همه باكتري‌ها، بجز دو جدايـــهP. fluorescens B120  و
B. circulans B112 در كاهش بيماري موثر بوده‌اند و 7 جدايه از آنها ضمن وجه اشتراك داشتن با قارچكش تري‌سيكلازول به‌ترتيب بعد از آن قرار گرفتند.

 در مرحله دوم ارزيابي، كنيديومهاي قارچ عامل بيماري از امكان پراكنش نرمال روي كليه بوته‌هاي برنج برخوردار بوده‌اند و مي‌توان براي نتايج ارزيابي در اين مرحله اهميت بيشتري قائل شــــد باكتري
 Bacillus circulans 17B در هر دو سال پس از تيمار قارچكش در بهترين گروه قرار دارد پس از آن، از جدايه 10B از همين گونه در سال دوم بهترين نتيجه حاصل شده است اين دو جدايه باكتري از قارچ عامل بيماري جداسازي شده‌اند كه به احتمال زياد همراه ريسه‌هاي بيمارگر بوده‌اند و به عبارت ديگر جزء فلور خود بيمارگر مي‌باشند و از اين نظر مي‌توانند جز بهترين آنتاگونيست‌ها تلقي شوند. بنابراين پس از كاربرد ديگر مشكل زيادي از نظر استقرار روي ميزبان نخواهند داشت(23). همه باكتريهاي مورد آزمايش در شرايط آزمايشگاه تأثير بسيار خوبي در جلوگيري از رشد رويشي و جوانه‌زني كنيديوم‌هاي بيمارگر داشته‌اند و همه آنها در آزمايش گلخانه‌اي تأثير بسيار معني‌داري در كاهش بيماري بلاست برگ نسبت به شاهد داشته‌اند (22). در سال دوم كه درصد آلودگي بلاست خوشه بيشتر بود درصد آلودگي در تعدادي ازباكتري‌ها به شاهد نزديك شده و از نظر آماري با آن وجه اشتراك پيدا كردند اما باكتري B. circulans 17B و Bacillus sp. B71  اثرشان در كنترل بيماري در مزرعه به قارچكش نزديك شد ضمن اينكه باكتري
B. circulans B118 نيز با شاهد تفاوت معني‌داري از نظر ميزان آلودگي به بلاست گردن داشته است اين باكتري در كنترل بيماري بلاست برگ در مرحله دوم ارزيابي نيز تأثير خوبي داشته است اين باكتري را نيز مي‌توان همانند جدايه 17B جزء فلور برگ برنج محسوب نمود چون از كشت لكه‌هاي بلاست برگ جداسازي شده است. باكتري‌هاي B. circuluns 17B و B. circulans B118  از جهت محل جداسازي همانند باكتري مذكور از ميسيليوم‌هاي بيمارگر جداسازي شده‌اند كه اين صفت مهمي در كاربرد ميكروارگانيزمهاي آنتاگونيست مي‌باشد(12). دوجدايه باكتري موردنظر (B118, 17B) علاوه بر ساكن بودن روي برگ‌هاي برنج و حتي روي ميزبان(بيمارگر)، بشدت در كاهش جوانه‌زني كنيديوم‌هاي بيمارگر در بررسي‌هاي آزمايشگاهي موثر بوده‌اند(22).

 كنترل شيمايي بيماري بلاست

            به منظور كاهش خسارت بيماري تلاش‌هاي فراواني صورت گرفته و  مواد شيميايي زيادي طي سال‌هاي طولاني تهيه و مصرف شده است اما مقاوم شدن عامل اين بيماري در مقابل غالب آنها از مسايل مهم مبارزه با آن شده است.  جستجوي مداوم براي پيدا كردن منابع ژني مقاومت نيز يكي از موارد مهم تحقيقات اين محصول بوده است بطوري‌كه تاكنون 25 ژن « مقاومت ماژور» شناخته شده است(8 و9 ).  اما  شكستن مقاومت ارقام اصلاح شده در مدت كوتاهي پس از كشت آنها در مزرعه از مسايل ديگر مبارزه با اين بيماري است، چنانكه ژاپن به‌طور مكرر با اين پديده روبرو شده است و اين بيماري هنوز مهم‌ترين بيماري در ژاپن است. در چين نيز اين بيماري به همراه بيماري سوختگي غلاف به عنوان مخربترين بيماري برنج محسوب مي‌شودو در امريكا به عنوان دومين بيماري مهم برنج بشمار مي‌رود  اما در هند در سالهاي اخير بيماري بلاست نسبت به بيماري‌هاي بلايت باكتريايي سوختگي غلاف و پوسيدگي غلاف  اهميت كمتري دارد. با وجودي كه در چند دهه، تحقيق در پروژه‌‌هاي ملي كشورهايي مانند كره، چين، هند، ژاپن و موسسه بين‌المللي تحقيقات برنج انجام شده، هنوز اين بيماري به عنوان يك مشكل مرموز در اكوسيستم‌هاي برنج در مناطق استوايي و معتدله تلقي مي‌گردد(21).

اهميت مبارزه شيميايي :

            حدود  35 درصد از توليد غذايي جهان قبل از برداشت توسط حشرات، عوامل بيماري‌زاي گياهي و علفهاي هرز از بين مي‌روند و بعد از برداشت نيز حدود 10 تا 20 درصد ديگر به آن خسارت وارد مي‌شود.  بنابراين حدود48 درصد از توليد بالقوه غذايي جهان توسط آفت‌ها نابود مي‌گردد و اين امر تلاش‌هايي كه براي كنترل آفات توسط آفت‌كشها و روش‌هاي جانشيني غيرشيميايي انجام مي‌گيرد را توجيه مي‌نمايد، اما استفاده از آفت‌كشها اثرات سوء زيست‌محيطي همچون مسموميت انسان‌ها، حيوانات، آلودگي‌هاي غذايي و … را نيز در پي دارد.  هنوز استفاده از آفت‌كشها اهميت ويژه‌اي در مبارزه با عوامل خسارت‌زاي زنده دارند مخصوصاً در شرايطي كه روش‌هاي جانشيني براي آنها پيدا نشده و يا در صورت موجود بودن، بسته به نوع رقم و يا منطقه قابل استفاده نمي‌باشد.  براي مثال در ژاپن ارقام برنج اصلاح شده مقاوم به بيماري بلاست بسرعت مقاومت خود را از دست مي‌دهند و شكستن مقاومت ارقام برنج بطور مكرر در آن كشور اتفاق مي‌افتد و يا در شمال كشورمان به دلايل اقتصادي و فرهنگي هنوز كشت ارقام بومي خوش‌كيفيت و حساس به اين بيماري از جايگاه ويژه‌اي برخوردار است (21) . بنابراين در چنين شرايطي مصرف قارچ‌كش‌ها به دليل اهميت خسارت حاصله در شرايط مساعد الزامي است.  خسارت اين بيماري در اپيدمي سال 1353 در استان گيلان  10درصد برآورد شد(17).  با توجه به اهميت خسارت ناشي از بيماري مصرف قارچكش‌ها در چنين شرايطي براي حفظ محصول بدون توجه به مسايل اقتصادي به‌طور چشمگيري افزايش مي‌يابد. در ويتنام در بعضي مناطق حتي 5 الي 6 مرتبه سمپاشي صورت مي‌گيرد و در كره بطور معمول 5 مرتبه، كه در مواقع اپيدمي بيماري نياز به تكرار سمپاشي مي‌باشد.  در ژاپن مصرف قارچكشها عليه اين بيماري بطور گسترده‌اي صورت مي‌گيرد. اين عمل حتي وقتي كه بيماري شديد هم نباشد از نظر اقتصادي امكان‌پذير است چون ارزش محصول برنج در اين كشور 2 الي 3 برابر قيمت جهاني آن است.  بنابراين واضح است كه چرا توليد برنج بزرگترين تجارت آفت‌كشها در جهان را فراهم نموده است.  از 4/2 ميليارد دلار تجارت آن در سال 1988، 570 ميليون دلار آن مربوط به قارچكشها بوده، كه حدود %92 آن براي كنترل بيماري بلاست برنج مصرف شده است(21).

سابقه مبارزه شيميايي با بيماري بلاست :

به علت اهميت كشت و كار برنج در ژاپن و خسارات ناشي از اين بيماري، اين كشور فعال‌ترين كشور در زمينه تحقيق و توليد مواد شيميايي براي كنترل اين بيماري بوده است.  اولين تركيباتي كه براي اين منظور به‌كار گرفته شد تركيبات مسي بود و از سال 1923 به بعد مخلوط« بردو» و ديگر تركيبات مسي به‌طور وسيع در مناطق خنك ژاپن كه اين بيماري شايع بوداستفاده شدند اما اين تركيبات دو ايراد داشتند يكي اين‌كه باعث گياه‌سوزي در برنج شده و گاهي بجاي افزايش، سبب كاهش محصول مخصوصاً به هنگام كاهش شدت بيماري مي‌شدند، ديگر اينكه در شرايطي كه بيماري بشدت اپيدمي مي‌شد قادر به كنترل آن نبودند.

بعد از جنگ جهاني دوم قارچ‌كش‌هاي مسي مخلوط با « استات فنيل مركوريك»                                                                                                                                                                                                                                                                                      استفاده شد كه هم تأثير بهتري در كنترل بيماري داشتند و هم گياه‌سوزي آنها كمتر بود.  در سال 1950 كشف شد كه مخلوط« استات فنيل مركوريك» با آهك آب‌ديده (آهك كشته) داراي تأثير فراواني است ضمناً گياه‌سوزي آن بسيار كم و ارزانتر است، به ‌همين دليل اين مخلوط به‌طور وسيع استفاده شد. تحقيقات بعدي در ژاپن و هند نشان داد كه بعضي از آنتي‌بيوتيكها مي‌توانند جانشين قارچ‌كش‌هاي فلزي شوند.  بدنبال آن اولين بار گزارش شدكه عصاره فيلتر شده Cephalothecium sp. بطور كامل از جوانه‌زني كنيديهاي قارچ عامل بيماري جلوگيري نمود و سفالوتسين ناميده شد.  پس از اين كشف، آنتي‌بيوتيكهاي زيادي توسط محققان ديگر مورد آزمايش قرار گرفت.  هم‌زمان با معرفي آنتي‌بيوتيك‌ها براي كنترل بيماري بلاست، در دهه 1960 قارچ‌كشهاي جديد ديگري از گروه تركيبات آلي فسفره كشف شدند.  كيتازين‌پي و ادي‌فنفوس از آن جمله‌اند كه بترتيب در سالهاي 1965 و 1967 در ژاپن به ثبت رسيدند. در سال 1970 يك تركيب آلي كلره بنام فتاليد (رابسايد)، در سال 1974 قارچ‌كشهاي ايزوپروتيولان (فوجي‌وان) و پروبنازول (ارويزه‌ميت) و در سالهاي 1981 و 1985 بترتيب قارچكشهاي تري‌سيكلازول و پيروكيلون به ثبت رسيدند.  مبارزه با بيماري بلاست كه ابتدا با قارچ‌كشهاي غيرآلي مسي شروع شده بود در دهه 1950 از تركيبات آلي جيوه‌اي سپس از آنتي‌بيوتيك‌ها و تركيبات آلي فسفره در دهه 1960 ادامه پيدا كرد  و سرانجام در دهه‌هاي 1970 و 1980 از قارچ‌كشهاي سيستميك با تركيبات شيميايي مختلف استفاده شده است.  قارچ‌كشهاي جديد جايگزين قديم‌تر‌ها شدند چون بيماري را بهتر كنترل نموده، داراي خاصيت گياه‌سوزي كم، حداقل سميت براي حيوانات و تأثير كمي روي محيط زيست داشتند.  در حال حاضر در كشورهايي نظير ژاپن، كره و تايلند قارچ‌كشهاي ادي‌فنفوس، ايزوپروتيولان، كيتازين‌پي، تري‌سيكلازول، پيروكيلون، فتاليد، پروبنازول، بلاستي‌سيدين‌اس، كاسوگاميسين، كوسوميرون، فريم‌زون، بنوميل (بنليت)، تيانبدازول(تكتو)، كاربندازيم (باويستين/دروزال)، تيوفانات متيل(توپسين‌ام)، كاروسان و كاسورابي‌سايد براي كنترل اين بيماري توصيه شده است(21).

در ايران قارچكشهاي« ادي‌فنفوس»،« بنوميل»،« توپسين‌ام»، «كاربندازيم»، «كيتازين» و «كاسومين» در گيلان مورد آزمايش قرار گرفتند كه اثر قارچكش« ادي‌فنفوس» بهتر از بقيه تشخيص داده شد،  ضمن اينكه بقيه قارچكشها نيز در جلوگيري از اين بيماري مؤثر بوده‌اند (5). ايزديار(7) نيز قارچكشهاي ادي‌فنفوس و تري‌سيكلازول و اخوت و شريفي‌تهراني(4) تري‌سيكلازول را مؤثر‌تر از ساير قارچ‌كشهاي مورد آزمايش براي كنترل بيماري بلاست تشخيص دادند.  قارچكش پيروكيلون (گرانول %5) نيز در سالهاي اخير در گيلان مورد آزمايش قرار گرفت.  نتايج حاصله نشان داد كه قارچ‌كش مذكور تأثير خوبي در جلوگيري از بروز بيماري در هر دو مرحله برگ و خوشه داشته است(9).

مشخصات برخي قارچكشهاي مهم ثبت شده عليه بيماري بلاست :

1-بلاستي سيدين‌اس : اين سم اولين آنتي‌بيوتيك مورد مصرف در كشاورزي است كه در سال 1961 در ژاپن كشف شد.  نحوه مصرف آن بصورت گردپاشي و محلول‌پاشي روي برگ‌ها است.  اين قارچكش فعاليت بازدارندگي شديدي روي رشد ميسيليوم در بافتهاي مورد حمله دارد.  همچنين از جوانه‌زدن اسپورها و تشكيل آپرسوريوم جلوگيري مي‌كند اما دز مؤثر آن در گياه دوام زيادي ندارد.  مقاوم شدن قارچ عامل بيماري بلاست در مقابل آن در مناطقي كه مورد استفاده قرار گرفت گزارش شده است.  عمل اين آنتي‌بيوتيك و آنتي‌بيوتيكهاي كاسوگاميسين و سيكلوهگزايميد مسدود كردن سنتز پروتئين در سطح ريبوزوم است.

2-كاسوگاميسين : اين آنتي‌‌بيوتيك در سال 1965 در ژاپن به ثبت  رسيد.  كاسوگاميسين فعاليت بازدارندگي شديدي روي رشد ميسيليومي دارد اما فاقد خاصيت جلوگيري‌كنندگي از جوانه‌زدن اسپورها و تشكيل آپرسوريوم مي‌باشد.  اين قارچكش به آساني از سطح برگها و ريشه جذب مي‌شود و خاصيت سيستميك دارد.  مقاومت به اين قارچكش در مناطق زيادي گزارش شده است به همين دليل كاسوگاميسين اكثراً بصورت مخلوط با« فتاليد» مصرف مي‌شود.

3-كيتازين‌پي : كيتازين‌پي يك قارچكش فسفره آلي است كه در سال 1965 در ژاپن به ثبت رسيد.  اين قارچ‌كش خاصيت ممانعت‌كنندگي در مقابل جوانه‌زني اسپور، نفوذ، رشد ميسيليومي و اسپورزايي قارچ عامل بيماري بلاست دارد، به همين دليل مي‌توان از آن براي اهداف پيشگيري و معالجه استفاده كرد.  بعد از كشف فعاليت زياد سيستميكي آن، بصورت گرانول تهيه و در مزرعه مصرف مي‌شود،  اگر چه مصرف آن بيشتر بصورت محلول‌پاشي در سطح برگها توسعه يافته است.  مقاومت به آن در قارچ عامل بيماري بلاست گزارش شده است و تعداد زيادي از جدايه‌هاي مقاوم به اين قارچ‌كش در مقابل قارچ‌كشهاي ادي‌فنفوس و ايزوپروتيولان نيز مقاوم بوده‌اند.

4-ادي‌فنفوس : ادي‌فنفوس يك تركيب فسفره آلي است كه در سال 1967 به ثبت رسيد.  فعاليت بازدارندگي آن مشابه كيتازين است ولي خاصيت معالجه‌كنندگي آن عالي‌تر از كيتازين و تأثير باقيمانده آن به مدت طولاني دوام دارد اما فعاليت سيستميكي آن ضعيف است.  اين قارچكش تأثير خوبي در كاهش اسپورزايي و توسعه لكه‌هاي بيماري بلاست دارد ولي پايداري آن در مقابل شستشو در اثر بارندگي كم است.  مصرف آن روي برگها در كنترل  پوسيدگي ساقه و لكه‌برگي ناشي از قارچ« هلمينتسپوريوم » نيز مؤثر است.

5- ايزوپروتيولان : اين قارچكش كه در سال 1974 به ثبت رسيده براي محلول‌پاشي در
 سطح برگ‌ها و پاشيدن در آب مزرعه و جعبه‌هاي نشاء مصرف مي‌گردد.  اين قارچكش
 بشدت از نفوذ و طويل‌شدن هيف عفوني قارچ عامل بيماري حتي در غلظت كم جلوگيري
مي‌كند.  علاوه بر آن از جوانه‌زني اسپور و تشكيل آپرسوريوم  ممانعت مي‌كند.  اين قارچكش مخصوصاً تأثير خوبي در كنترل بلاست خوشه دارد و بهترين زمان مصرف آن دو تا سه هفته قبل از خوشه‌دهي است.  نقطه اثر اين قارچكش و قارچكشهاي ادي‌فنفوس و كيتازين در بيوسنتز فسفوليپيد غشاي سلولي است.

6-فتاليد : اين قارچكش در سال 1970 به عنوان يك تركيب كلره آلي به ثبت رسيد.  خاصيت گياه سوزي  روي برنج و ساير محصولات ندارد و فعاليت حفاظتي پايداري در مقابل بيماري بلاست برنج دارد. خاصيت ممانعت‌كنندگي آن در مقابل نفوذ به داخل سلولهاي اپيدرم برگ بسيار قوي مي‌باشد.  بعلاوه از اسپورزايي قارچ عامل بيماري بلاست در سطح لكه‌ها در حد قابل اطميناني جلوگيري مي‌كند.  فتاليد بطور گسترده در ژاپن بصورت محلول پاشي در سطح برگها مصرف مي‌شود و اثر كنترل‌كنندگي آن بعد از مصرف چندان تحت تأثير باران قرار نمي‌گيرد. 

7- پروبنازول : پروبنازول در سال 1974 در ژاپن به ثبت رسيد.  اين قارچكش بطور چشمگيري از نفوذ قارچ عامل بيماري ممانعت بعمل مي‌آورد.  مصرف آن محرك توليد مواد ضدقارچي در برنج است كه از رشد قارچ عامل بيماري جلوگيري كرده و تأثير بسيار زيادي در كنترل بيماري دارد بعلاوه اثر باقي‌مانده آن نيز بسيار طولاني است.  اين تركيب براي كنترل بيماري سوختگي باكتريايي برگ برنج نيز قابل استفاده است.

8- تري‌سيكلازول: تري‌سيكلازول قارچكشي سيستميك است كه در سال 1981 در ژاپن به ثبت رسيد.  تأثير اين قارچكش روي رشد ميسيليومي و جوانه‌زني اسپور، ضعيف و روي تشكيل آپرسوريوم و اسپورزايي متوسط است ولي اثر آن در جلوگيري از نفوذ و بيماريزايي پاتوژن بسيار زياد است. مصرف اين قارچكش در سبدهاي نشا و محلول‌پاشي در سطح برگها تأثير بالايي در كنترل بيماري بلاست دارد.  بهترين زمان مصرف آن براي كنترل بلاست خوشه چند روز قبل يا بعد از ظهور اولين خوشه‌ها است.  تأخير در مصرف آن تا ظهور كامل خوشه‌ها، ممكن است موفقيتي در كنترل بيماري خوشه‌هاي اوليه بدست نيايد.  مقدار مصرف آن بصورت پودر وتابل، 250-150 گرم ماده مؤثره در هكتار است. يكبار مصرف آن بصورت محلول‌پاشي در سطح برگها 20 روز گياه را از بيماري بلاست محافظت مي‌كند.  در تايوان از مصرف سوسپانسيون پودر وتابل %75 تري‌سيكلازول در خزانه به نسبت 2-5/0 گرم ماده مؤثره در متر مربع، 24-0 ساعت قبل از انتقال نشاها و با ميانگين 3 ليتر آب در متر مربع نتايج مثبتي بدست آمده است اما نتايج آن در ژاپن موفقيت‌آميز نبود كه علت آن انتقال خاك حاوي تري‌سيكلازول چسبيده به ريشه نشاها در زمان نشاكاري در تايوان است، در حاليكه در ژاپن نشاها هنگام انتقال بدون خاك هستند.

پوشش‌دهي بذور با تري‌سيكلازول به نسبت 3-1 گرم ماده مؤثره در كيلوگرم بذر در كشت مستقيم، بيماري بلاست برگي را در اوايل فصل كنترل مي‌كند اما اگر اين نشاها، نشاكاري شوند اثر آن از بين خواهد رفت. شسته شدن تري‌سيكـلازول از سطح برگها در اثر باران كم است.  بنابراين علي‌رغم بارندگي در مدت كوتاهي پس از محلول‌پاشي آن در سطح برگها، فعاليت آن دوام خواهد داشت.  علت آن جذب سريع از طريق برگها است كه چيزي در سطح برگها براي شسته شدن باقي نمي‌ماند.

9- پيروكيلون: پيروكيلون يك قارچكش سيستميك است كه در سال 1985 در ژاپن به ثبت رسيد.  نحوه عمل اين قارچكش ممانعت از بيوسنتز ملانين در آپرسوريوم قارچ عامل بيماري بلاست است كه در نتيجه سبب جلوگيري از نفوذ آن در اپيدرم  ميزبان مي‌شود، بعلاوه توليد كنيدي از لكه‌هاي موجود نيز كاهش مي‌يابد دوام اثر باقي‌مانده آن نيز بسيار طولاني است.   اين نحوه اثر بسيار شبيه اثر تري‌سيكلازول و كلوبنتيازون است ولي بررسيهاي اخير تفاوتهايي بين اين قارچكشها با قارچكش فتاليد را پيشنهاد نموده است.

پيروكيلون با نامهاي كوراتوپ بصورت گرانول 2 و 5 درصد و فونگورن  به صورت پودر 50WP و 50WS عرضه شده است.  كوراتوپ 2% عمدتاً  قبل از بذرپاشي با خاك سيني نشا (به نسبت 10-5 گرم در cm²1800 سطح سيني) مخلوط مي‌شود، كوراتوپ 5%  بصورت پاشيدن در آب مزرعه براي كنترل بيماري بلاست در مرحله برگ به نسبتkg/ha30 و 10-5 روز قبل از ظهور علايم بيماري (با پيش‌بيني) و به نسبت kg/ha40  15-10 روز قبل از خوشه‌دهي براي كنترل بيماري بلاست در مرحله خوشه توصيه شده است.  عمق آب در مزرعه نيز حداقل بايد cm3 بوده و مدت 4-3 روز نيز به همين نسبت حفظ شود.  فونگورن 50wp بصورت محلول‌پاشي در سطح برگها براي كنترل هر دو مرحله بيماري (برگ و خوشه) عرضه شده است. توصيه مي‌شود،  براي كنترل بلاست برگ با ظهور اولين علائم بيماري و براي بلاست خوشه با ظهور اولين‌ خوشه‌ها با اين تركيب به نسبت kg/ha 1-6/0 سطح مزرعه محلول‌پاشي گردد

 فونگورن:

 فونگورن 50ws براي ضدعفوني بذر به منظور كنترل بيماري بلاست در مرحله برگ در كشت مستقيم (آبي) و كشت خشك و آپلند ساخته شده است.  مقدار مصرف آن براي كشت مستقيم 8-4 گرم و براي كشت خشك 4-2 گرم به ازاي هر كيلوگرم بذر است.  بدين منظور هر كيلوگرم بذر با 20-10 ميلي‌ليتر آب خيس شده و سپس قارچكش به آن اضافه و در ظرفي بخوبي تكان داده مي‌شود تا تمام قارچكش بطور يكنواخت به بذر بچسبد.

در روش ديگر 20-10 ميلي‌ليتر آب را به مقدار قارچكش مورد نظر به ازاي يك كيلوبذر اضافه و مخلوط كرده و سپس  به يك كيلو بذر خشك اضافه مي‌شود و در ظرفي بخوبي تكان داده تا قارچكش بطور يكنواخت به بذور بچسبد.  اين روش مخصوصاً براي مصرف در سطح وسيع، نسبت به روش قبلي ترجيج داده شده است. قارچكش پيروكيلون به همراه قارچكشهاي تري‌سيكلازول، فتاليد و پروبنازول به گروه غير قارچكشهاي كنترل‌كننده بيماري معروف هستند كه از نظر نحوه اثر دو نوع هستند، دسته اول شامل تري‌سيكلازول، فتاليد و پيروكيلون كه از بيوسنتز ملانين جلوگيري مي‌كنند و دسته دوم شامل پروبنازول يا اوريزه‌ميت است كه عامل اوليه براي تحريك برنج جهت مقاوم شدن در مقابل پاتوژن است (21).

 در بررسي ديگر اثر قارچكشهاي كار پروپاميد (Win) و تري‌سيكلازول هر يك در دو دز روي بيماري بلاست در مرحله برگ و خوشه و ميزان محصول در مزرعه و بصورت ضدعفوني بذر، ضدعفوني نشاء برنج و محلول پاشي در مرحله برگ و خوشه بصورت طرح اسپليت پلات در سه تكرار مورد ارزيابي قرار گرفت. در نتيجه مشخص گرديد كه هيچ يك از تيمار قارچكشها در كاهش بيماري بلاست در مرحله برگ بصورت ضدعفوني بذر مؤثر نبوده‌اند در حاليكه اثر همه آنها بصورت ضدعفوني نشاء در كاهش بيماري مشابه  با محلول پاشي در مرحله برگ بوده و تأثيري معني‌داري نسبت به شاهد داشته‌اند. يعني اينكه اگر نشاها را در محلول سم غوطه‌ور نمائيم و بعد بكاريم، تأثيري كه در كاهش بيماري بلاست برگ دارد مشابه با محلول‌پاشي قارچكش‌هاي مذكور در مزرعه است بنابراين بسيار مقرون بصرفه و سهل‌تر است كه از روش غوطه‌وركردن استفاده شود و اين به لحاظ مشقت كار زارع بسيار با اهميت است. در روش غوطه‌ور كردن، ريشه نشاهاي  مورد نياز در 18 ليتر محلول هر يك از دو قارچكش كارپروپاميد و تري‌سيكلازول به ترتيب به نسبت‌هاي 4 ميلي‌ليتر و دو گرم در ليتر به مدت 3 ساعت و دو ساعت قرار داده و سپس نشاءكاري گرديد. 

 همه تيمارهاي قارچكش‌ها در كاهش بيماري بلاست در مرحله خوشه و جلوگيري از كاهش محصول موثر بوده‌اند(18).

مقاومت به قارچكشها

            شتاب و تلاش گسترده بشر در جهت مبارزه شيميايي با عوامل زنده زيان‌آور براي بدست آوردن سهم بيشتري از محصولات غذايي جهان كه خود آنرا توليد كرده و به همين دليل خود را صاحب و مستحق مالكيت آن مي‌داند، عاملي در محدودكردن اين روند تماميت‌خواهي بشر شده است.  مسلم است كه آفت‌كشها نقش مهمي در پايداري توليد غذا و نگهداري آن دارند اما خطراتي را به دنبال داشته است از جمله خطرات انساني :  شامل سميت حاد، مزمن، سرطان‌زايي، تغييرات شگفت‌آور و هولناك مادرزادي و تجمع بيولوژيكي.  خطرات زيست‌محيطي شامل آلودگيهاي رودخانه‌ها، آبهاي زيرزميني هوا و خاك و نابودي اكوسيستم كه نابودي حيات وحش و افزايش در مقاومت را شامل مي‌شود. ظهور مقاومت در آفات  در مقابل سمومي كه عليه آنها بكار گرفته مي‌شوند يكي از عوامل توقف و يا كاهش رشد فزاينده مصرف آنها شده است.  پس از معرفي DDT و مصرف آن، هفت گونه حشره مقاوم به آن در سال 1938 شناخته شد و تعداد آنها تا سال 1984 بطور نگران‌كننده‌اي به 450 گونه افزايش يافت(21).

اولين گزارش مقاومت در قارچ عامل بيماري بلاست برنج در مقابل استات فنيل مركوريك در سال 1958 و در مقابل سولفات مس، اسيدبوريك و كلرايد جيوه در سال 1964 انتشار يافت.  بدنبال معرفي آنتي‌بيوتيكهاي بلاستي‌سيدين‌اس و كاسوگاميسين تفاوت‌هايي در حساسيت قارچ عامل بيماري بلاست نسبت به آنها پيدا شد. اهميت اين مشكل تا سال 1971 كه اثر كاسوگاميسين در مزارع ياماگوتاي ژاپن كاهش يافت آشكار نشده بود ولي نژادهاي مقاوم در مناطقي كه كاسوگاميسين در تلفيق با فتاليد و يا در تناوب با قارچكشهاي فسفره آلي مصرف مي‌شد مشاهده نشد(32).

ميورا و همكاران(30) در گزارشي آورده‌اند كه كاسوگاميسين در ژاپن از سال 1969 تا سال 1971 چهار تا پنج بار در هر فصل زراعي استفاده شد و كلاً %90 كل سموم مصرفي براي كنترل بيماري بلاست را به خود اختصاص داد و در پايان فصل زراعي سال 1971 جمعيت جدايه‌هاي مقاوم به 90 درصد رسيد به همين دليل توصيه شد كه از سال بعد بجاي آن از يك قارچكش فسفره آلي استفاده گردد.  چند سال پس از بكار بستن اين توصيه جمعيت جدايه‌هاي مقاوم به %20 كاهش يافت.  قارچكش كيتازين (IBP) در سال 1967 بعنوان كنترل‌كننده بيماري بلاست برنج معرفي شد و در سال 1976 اولين گزارش مقاومت به آن در مناطق توياما¹ و نيگاتا² انتشار يافت و بطور كلي مقاومت به قارچكشهاي فسفره آلي شامل كيتازين، هينوزان و فوجي‌وان در مناطقي كه تداوم مصرف داشت بكرات گزارش شده است(21). 

از زمان معرفي و كاربرد اولين مواد شيميايي براي كنترل بيماري بلاست تاكنون تنها يك گروه از آنها كماكان بدون اينكه مقاومتي به آنها گزارش شده باشد همچنان در تناوب با گروه‌هاي ديگر قارچكشها استفاده مي‌شود.  اين گروه به كنترل‌كننده‌هاي غيرقارچكش معروف مي‌باشند كه شامل تري‌سيكلازول، فتاليد و پيروكيلون كه از بيوسنتز ملانين جلوگيري مي‌كنند و ديگري پروبنازول است كه باعث مقاوم شدن گياه در مقابل پاتوژن مي‌شود اين گروه قارچكشها علي‌رغم  بيش از ده سال استفاده از آنها هنوز مقاومتي به آنها گزارش نشده است(21)

 

بررسي مقاومت قارچ عامل بيماري بلاست برنج‌ درمقابل قارچكشهاي مورد مصرف در گيلان

در استان گيلان قارچكشهاي « ادي‌فنفوس و تري‌سيكلازول » سالهاي نسبتاً طولاني عليه بيماري بلاست برنج استفاده شده است به همين دليل در اين آزمايش اثر دزهاي مختلف اين دو قارچكش به اضافه قارچكش بنوميل كه قبلاً در سطحي وسيعتر و در شرايط فعلي در سطحي كمتر عليه اين بيماري استفاده مي‌شوند در جلوگيري از رشد ميسليومي50 جدايه از قارچ عامل بيماري كه از نقاط مختلف استان جمع‌آوري و جداسازي شدند مورد مطالعه قرار گرفت.  براي اين كار دزهاي 100، 150، 200 و 250پي‌پي‌ام از ماده موثره تري‌سيكلازول 1، 10، 20 و 30 پي‌پي‌ام از ماده موثره ادي‌فنفوس و 1/0 ، 1، 2 و 4 پي‌پي‌ام ماده مؤثره بنوميل در محيط كشت PDA داخل تشتكهاي پتري تهيه گرديد(هر دز در سه تكرار).  سپس قرصي به قطر 7 ميلي‌متر از چهار جدايه مختلف از قارچ عامل بيماري در چهار گوشه تشتك كشت داده و در انكوباتور با حرارت 27 درجه سانتي‌گراد با نور متناوب 12 ساعته نگهداري گرديد.  ميزان رشد كلني جدايه‌ها به فواصل 5 و 7 روز اندازه‌گيري شد.  جدايه‌هايي كه در اين فاصله رشدي نداشته و يا در غلظت‌هايي از هر قارچكش رشد كمي داشتند پس از 14 روز مورد بازبيني و اندازه‌گيري قرار گرفت.  هر جدايه كه رشد آن در فاصله 14 روز در دزهاي مورد آزمايش به علت رشد بيشتر و ادغام جدايه‌ها در يكديگر قابل اندازه‌گيري نبود مجدداً و بطور جداگانه در مركز تشتك پتري حاوي محيط كشت PDA  و غلظت مورد نظر قارچكش كشت و مورد اندازه‌گيري قرار گرفت.  در مرحله بعد جدايه‌هايي كه بالاترين غلظت ذكر شده قارچكش ادي‌فنفوس قادر به رشد بودند به غلظتهاي بالاتر آن منتقل شدند، اين روند بررسي و اندازه‌گيري تا دز 140 پي‌پي‌ام ادامه يافت (21).

 نتايج:

مناطق نمونه‌برداري براي جداسازي قارچ عامل بيماري بلاست برنج در استان نشان مي‌دهد كه اين مناطق از تنوع و گستردگي لازم برخوردار بوده و مخصوصاً مناطقي كه اين بيماري بيشتر شايع و اپيدمي مي‌شود يعني مزارع اطراف شهرستانهاي رودسر، لنگرود، لاهيجان، آستانه و رشت را تحت پوشش قرار داده است. از سالهاي گذشته تاكنون در اطراف شهرستانهاي لاهيجان و آستانه مبارزه شيميايي با بيماري بلاست برنج در هر دو مرحله برگ و خوشه بطور گسترده‌تري پي‌گيري شده است و از زمان توصيه قارچكش
«ادي‌فنفوس» براي اين امر از سال 1355 مورد مصرف قرار مي‌گيرد.  همانطور در اين جدول آمده است از 50 جدايه جمع‌آوري شده در سطح استان، دو جدايه قادر به رشد در دز 140 پي‌پي‌ام از ماده مؤثره اين قارچكش بوده‌اند كه متعلق به اين دو شهرستان مي‌باشند در حاليكه در شهرستانهاي فومن، شفت و صومعه‌سرا كليه جدايه‌ها در غلظت كمتري از اين قارچكش كنترل شده‌اند(21).

مقاومت به قارچكش‌هاي فسفره آلي شامل « كيتازين»، « ادي‌فنفوس» و« فوجي‌وان» كه از بيوسنتز ليپيد در غشاي سلولي جلوگيري مي‌كنند در مناطقي از نواحي برنج‌خيز جهان كه تداوم مصرف داشته‌اند بكرات گزارش شده است.  ايزديار ( 7) در بررسيهاي خود نشان داد كه قارچ عامل اين بيماري هيچگونه رشدي در 50 پي‌پي‌ام از اين قارچكش نداشته است در حاليكه در دز 25 پي‌پي‌ام قادر به رشد بوده است.

            در اين بررسي كل جدايه از نظر مقاومت به قارچكش ادي‌فنفوس به چهار گروه تقسيم شدند.  گروه اول جدايه‌هايي كه حداكثر تا 10 پي‌پي‌ام از قارچكش مذكور قادر به رشد بودند كه به نام گروه حساس تعيين شدند.  انتخاب اين گروه بر اساس جدايه رستم‌آباد صورت گرفت كه بيماري بلاست در قسمت جنوبي اين شهر اهميت چنداني ندارد و مبارزه شيميايي با آن نيز انجام نمي‌شود.  بنابراين اين جدايه را مي‌توان به عنوان جدايه وحشي محسوب نمود و ساير جدايه‌ها از مناطق ديگر كه حساسيت مشابه اين جدايه نسبت به اين قارچكش داشتند در گروه حساس قرار گرفتند.  گروه‌هاي ديگر شامل نيمه‌حساس، نيمه‌مقاوم و مقاوم كه بترتيب حداكثر تا 4، 8 و 14 برابر از غلظت مورد تحمل در گروه حساس قادر به رشد بوده‌اند(21).

همان‌‌طور كه ذكر شد قارچ‌كش ادي‌فنفوس در سال 1355 براي كنترل بيماري بلاست توصيه شده است (5) و از آن زمان تا‌كنون به‌طور مداوم مصرف مي‌شود،  بنابراين بروز مقاومت در قارچ عامل بيماري در مقابل آن، دور از انتظار نبوده است و چنانچه روند مصرف آن بر همين منوال همچنان ادامه يابد بايد منتظر افزايش جمعيت جدايه مقاوم به اين قارچ‌كش نيز بود. در اين شرايط لازم است به مديريت كنترل شيميايي اين بيماري در منطقه توجه بيشتري مبذول شود. اين قاچ‌كش براي كشاورزاني كه در تماس با آن هستند بسيار خطرناك است و از نظر مخاطراتي كه ماده موثر آن ايجاد مي‌كند از سوي سازمان بهداشت جهاني در گروه IB يعني بسيار خطرناك طبقه‌بندي شده است و شايد به همين دليل تا‌كنون در انگلستان به ثبت نرسيده است. ولي هنوز در بعضي از كشورهاي توليد كننده برنج نظير ژاپن، تايلند و كره، براي مبارزه با بيماري بلاست توصيه مي‌شود. اما در اين كشورها به منظور جلوگيري از بروز مقاومت در قارچ عامل بيماري، تكرار سمپاشي و مصرف بي‌رويه سموم، قارچ‌كشهاي متنوعي مخصوصاً از جنبه مكانيزم تاثير روي پاتوژن ثبت شده و در دسترس كشاورزان قرار گرفته است چنانكه در تايلند 12 نوع و در ژاپن 10 نوع قارچ‌كش كه از نظر مكانيزم اثر، در چهار گروه قرار دارند براي اين منظور مورد استفاده قرار مي‌گيرد و بدين ترتيب مشكل  بروز مقاومت در پاتوژن را تحت كنترل در آورده‌اند. بنابراين لازم است در كشور ما نيز به منظور كاهش حجم مصرف قارچ‌كش «ادي‌فنفوس»، جلوگيري از بروز مقاومت بيشتر در پاتوژن و اپيدمي شدن بيماري، كاهش جمعيت استرين‌هاي مقاوم و ممانعت از تكرار عمليات سمپاشي تسهيلاتي فراهم شود تا با در دسترس قرار دادن قارچ‌كش‌هاي متنوع‌الاثر و مصرف متناوب آنها از بروز مشكلات جدي در آينده جلوگيري به عمل آيد (21).

 منابع:

1-  اسماعيل پور، م، ح- 1359- مطالعه عوامل مؤثر محيطي در روي بيماري بلاست برنج (2)-. نشريه آفات و بيماريهاي گياهي، جلد 48، شماره 2، 118- 105.

2-  اخوت، م- 1375- تأثير تاريخ كاشت در كنترل بيماري بلاست برنج- چكيده مقالات چهارمين كنگره علوم زراعت و اصلاح نباتات ايران، ص 31.

3-    اخوت، م. ؛ دانش‌وكيلي- 1376- برنج ( كاشت، داشت، برداشت )- انتشارات فارابي. 212 صفحه.

4-  اخوت ، م .  ؛ ع. شريفي‌تهراني - 1374 - بررسي اثر چند قارچ‌كش روي بيماري بلاست برنج و تعيين زمان مناسب كاربرد آنها- مجله بيماريهاي گياهي جلد 20 : 45 – 35 .

5-    اخويزادگان، م- 1335-  مقايسه چند قاچكش عليه بيماري بلاست. مجله بيماري گياهي جلد 12 (2-1) :8-1

6-  ايزديار ، م‌ - 1357-  بررسي مقاومت ارقام مختلف برنج محلي نسبت به قارچ بلاست در مزرعه . مجله بيماريهاي گياهي ، جلد چهاردهم.

7-  ايزديار ، م‌ -1361- معرفي تعدادي از نژادهاي فيزيولوژيك قارچ بلاست برنج
(Pyricularia oryzea Cav.) در استان گيلان- نشريه بيماريهاي گياهي 18: 57-52

8-    ايزديار، م- 1363-  مقايسه تأثير چندقارچكش در مبارزه با بلاست برنج-  مجله بيماريهاي گياهي جلد 20 :45-35.

9-  ايزديار، منوچهر ؛ ف، پاداشت-  1374-  مقايسه تأثير دو قارچكش گرانول در كنترل بيمار  بلاست برنج-  خلاصه مقالات دوازدهمين كنگره گياهپزشكي ايران. كرج، ص 81..

10-ايزديار، م- 1359- رابطه بين رشد ميسليوم قارچ Pyricularia oryzae CAV.در سلولهاي غلاف برگ با توسعه بيماري بلاست در ارقام مختلف برنج در مزرعه - مجله بيماريهاي گياهي، جلد 16، ص 22-15.

11-ايزديار، م- 1362- رابطه بين شرايط جوي و توسعه بيماري بلاست برگ و خوشه در ارقام مختلف برنج در استان گيلان- خلاصه مقالات هفتمين كنگره گياهپزشكي ايران، ص 85.

12- ايزديار، م- 1372- بيماري بلاست و روش هاي پيش‌آگاهي آن در استان گيلان- خلاصه مقالات يازدهمين كنگره گياهپزشكي ايران، ص 64.

13-ايزديار، م- 1372- روش هاي پيش آگاهي جهت مبارزه با بيماري بلاست برنج- چكيده مقالات اولين كنگره علوم زراعت و اصلاح نباتات ايران، ص 104.

14-ايزديار، م- 1372- رابطه بين تراكم اسپور در هوا و تراكم بلاست برگ(leaf blast) و درصد بلاست خوشه  (panicle blast) در ارقام مختلف برنج- خلاصه مقالات يازدهمين كنگره گياهپزشكي ايران، ص 63. 

15-ايزديار، م. ؛ ف. پاداشت ؛ م. بهرامي – 1376- گزارش نهائي طرح انتخاب دزهاي  پائين‌تر قارچكشهاي هينوزان و تريسكلازول روي بيماري بلاست برنج -  مؤسسة تحقيقات برنج كشور.

16-ايزديار، م. ؛ ف. پاداشت- 1374-  مقايسه تأثير دو قارچكش گرانول در كنترل بيماري بلاست برنج-  خلاصه مقالات دوازدهمين كنگره گياهپزشكي ايران، كرج، ص 81.

17-ايزديار، م- 1377-  بيماري بلاست برنج.  انتشارات نشر آموزش كشاورزي، 20 صفحه.

18-ايزديار، م. و همكاران- 1380- بررسي اثر قارچ‌كش win در مقايسه با قارچ‌كشهاي توصيه شده روي بيماري بلاست-

19-       بهداد، ا- 1359- بيماريهاي گياهان زراعي ايران - چاپ نشاط اصفهان . 424 صفحه .

20-    پاداشت، فريدون وهمكاران- 1382- مطالعه روي كنترل بيولوژيكي بيماري بلاست برنج- گزارش نهايي پروژه، شوراي پژوهشهاي علمي كشور، 39 صفحه.

21-پاداشت، ف- 1379 - كنترل شيميايي بيماري بلاست برنج و مقاومت قارچ عامل بيماري در مقابل قارچ‌كش‌ها- مؤسسة تحقيقات برنج كشور.

22-پاداشت، ف- 1380 - گزارش نهايي شناسايي عوامل بيولوژيك كنترل كننده بيماري بلاست برنج-  مؤسسة تحقيقات برنج كشور.

23-پاداشت، ف- 1384 - مطالعه تأثير چند باكتري آنتاگونيست در كنترل بيماري بلاست در شرايط مزرعه -  مؤسسة تحقيقات برنج كشور.

24-پاداشت، ف. و همكاران - 1383 - جستجوي منابع مقاومت به بيماري بلاست در كلكسيون برنج-  مؤسسة تحقيقات برنج كشور. ، گزارشات نهايي طرح تحقيقاتي.

25-پاداشت، ف. و م. ايزديار - 1386 - بررسي رابطة شدت بيماري بلاست با ميزان خسارت محصول برنج -  مؤسسة تحقيقات برنج كشور.، گزارشات نهايي طرح تحقيقاتي.

26-جوان نيكخواه ، م- 1380 - تحقيق روي تنوع ژنتيكي جمعيت قارچ عامل بيماري بلاست برنج ، با استفاده از خصوصيات مولكولي ، بيماريزايي و سازگاري رويشي در استان گيلان - دانشكده كشاورزي ، دانشگاه تهران.

27-موسي‌نژاد، ص- 1387-  معرفي يك مدل پيش‌آگاهي براي بيماري بلاست برنج و ارزيابي خسارت ناشي از اين بيماري در استان گيلان- رساله دوره دكتري رشته بيماري‌شناسي گياهي، دانشكده كشاورزي، دانشگاه تربيت مدرس. 157 ص.

28-  IRRI- 1989-  Biological control ; Blast control-  Annual Report for 1988.  The Philippines.  231-232.

29-  IRRI- 1994-  Association of biological control agent with blast and sheath blight lesions- Program Report for 1994.  The Philippines,  172.173

30-  Miura, H., & et al – 1973- Resistance of rice blast fungus to Kasugamycin.  Ann. Phytopathol.  Soc.  Jap.  39:239

31-  Ou, S.H-  1972-  Studies on stable resistance to rice blast disease.  In Rice  breeding- IRRI, The philippines, pp. 227-237.

32-  Ou, S. H- 1985-  Rice diseases-  380pp. Second Edition, C.A.B. UK

 

 

بسمه تعالي

دانشگاه جامع علمي كاربردي

موسسه آموزش‌ عالي علمي كاربردي – مجتمع آموزش عالي جهاد كشاورزي استان گيلان

 

پروژه:

دوره كارشناسی زراعت برنج

 

عنوان:

نقش كشت بافت در توسعه تحقيقات برنج

 

دانشجو: فردوس عادلی مسبب

 

استاد راهنما: مهندس اسماعيل پور کاظم

 

پاييز 1387

نقش كشت بافت در توسعه تحقيقات برنج نويسنده: فردوس عادلي مسبب

پیش‌گفتار

برنج غذای اصلی بیش از نیمی از جمعیت جهان است. تداوم اصلاح گیاه برنج هسته مرکزی برنامه های بهنژادی تشکیلات تحقیقات برنج همه کشورهاست. در حال حاضر توسعه تحقیقات برنج براساس ارزیابی ژنتیکی و بهره برداری گیاه برنج از راه برنامه هایی انجام مي شود كه توسط ایری در دسترس همه کشورها قرار گرفته است و عبارتند از:

 1 -  برنامه ریزی مشترک از راه هماهنگی در توسعه ارقام برنج مناسب در شرایط آب و هوایی مختلف.

 2  – توسعه متدولوژی.

3 - طبقه بندی و حفاظت ذخایر ژنتیکی برنج جهان.

4 - غربال گیری کلکسیون جهانی برنج برای یکسان سازی والدین دورگ گیری.

 5 - درک ماهیت و علل مقاومت و تحمل شرایط نامطلوب مختلف.

 6 - ارزیابی ژنتیکی مقاومت و تحمل برنج نسبت به معضلات گوناگون.

 7 - توسعه منابع اصلاح مقاومت و تحمل نسبت به عوامل نا مساعد.

 8 - ارزیابی زراعی و انتخاب لاین های اصلاح شده با عملکرد بالا (7).

از طرف دیگر، قد کوتاهی، ظرفیت پنجه زنی بالا، رنگ سبز تیره برگ و راست بودن آن، ویگوریتی رویشی خوب، زود رسی، کیفیت دانه مناسب، محتویات پروتیین بالا، مقاومت به اثرات خشک سالی، سرما و تحمل شرایط آب عمیق نیز در برنامه IRRI قراردارد (3 ). تا سال 2020 تولید جهانی برنج بایستی به 760 مگاتن برسد تا جواب گوی افزایش جمعیت کره زمین گردد. برای دست یابی به این اهداف بزرگ، به روش های جدیدی نیاز است. از آن جا که هر برنامه اصلاح گیاهان زراعی به گستردگی تغییرات ژنتیکی گیاه پایه بستگی دارد، نه تنها ایجاد این تنوع بلکه به حفظ و نگاهداری ذخایر ژنتیکی نیز بیش تر باید توجه شود. به همین دلیل، توسعه تحقیقات برنج با پیشرفت های بیوتکنولوژی همگام شده است. از طرف دیگر، استفاده از این روش ها برنامه های زادگیری مرسوم ( تلاقی ارقام به روش سنتی ) برای ایجاد تنوع ژنتیکی امکان پذیر گردیده است. بعضی از موفقیت های کشت بافت برنج عبارتند از:

1 - تولید‌ هاپلوییدها که موجب صرفه جویی زمانی و معرفی سریع تعدادی از ارقام برنج شده است.

2 - پدیده سوماکلون ها نشان دهنده تحمل در مقابل عوامل شوری و بیماری ‌زایی.

3- جداسازی لاین‌های سلولی جهش یافته با افزایش اسیدهای آمینه.

 4 - باززایی گیاهان کامل از پروتوپلاست‌های مجزّای فعّال تغییر ژنتیکی یافته و مطالعات دورگ گیری بدنی ( سوماتیک).

 5 - نگهداری کشت‌های آزمایشگاهی به حالت انجماد یا حفظ ذخایر ژنتیکی (5).

چکیده:

          تاسال 1967 تحقیقات برنج در سراسر جهان عمدتا به روش دورگ گیری انجام می شده است. این روش با مشکلات زیادی مواجه بود. اما با کشف روش کشت بساک نه تنها امکان بروز ژن های مغلوب فراهم گردید، بلکه عرصه های دیگری به روی تحقیقات برنج گشوده شد. برای مثال می توان روش های مختلف انتقال ژن را نام برد. کالوس زایی اولین و مهم ترین زیربنای پیشرفت و توسعه تحقیقات جدید گردید. به طوری که انتقال ژن به سلول های کالوس بهتر و آسان تر انجام می شد. برای تهیه سوسپانسیون سلولی نیاز به تولید کالوس است که در این سوسپانسیون ها تقسیم و ازدیاد سلول با سرعت زیادی انجام می گردد. از طرف دیگر، برای تهیه پروتوپلاست بایستی از سوسپانسیون سلولی استفاده کرد. البته برای باززایی و تولید گیاه هم، سوسپانسیون سلولی ماده اولیه مناسبی است. در ایران، با این که دولت هزینه سنگینی را در بیوتکنولوژی متحمل شده است اما به ندرت پیش رفت کاری در معرفی ارقام اصلاح شده جدید ملاحظه می شود. عملیات کشت مصنوعی در محیط های غذایی توانمندی های فراوانی را برای انسان به ویژه برای جوانان گشوده است تا قدرت خلاقه خود را در این میدان بزرگ به کار گرفته و بی محابا بتازند. این پروژه در سطح کارشناسی برنج ارائه شده و به چگونگی تأثیر کشت بافت در توسعه تحقیقات برنج می پردازد و هدف آن توضیح روش کار نیست. اگرچه، کارهای بزرگی در پشت آن پنهان است که از جمله تولید برنج C₄ می باشد که همیشه کاری نشدنی قلمداد می گردیده است.        

تاریخچه

یکی از مهم ترین رویدادهای بیولوژیکی در چرخه حیات موجودات زنده لقاح یعنی امتزاج گامت های جنسی متضاد و تشکیل سلول تخم است. هابرلند (1898 ) اولین کسی بود که به کشت سلول کاملا تمایز یافته اهتمام ورزید. با این که تلاش های او ناموفق بود، پیشقراول چنین آزمایش هایی بوده است. پس از هابرلند، در سال 1922 دوتن به نام های روبین ( آمریکایی ) و کوت ( یکی از شاگردان هابرلند در آلمان ) تحقق کشت بافت ریشه را به طور مستقل از هم گزارش کردند. روبین و مانوال ( 1929 ) در کشت مریستم انتهای ریشه موفقیت هایی کسب کردند، اما واضح ترین گزارش به وایت ( 1934 ) در کشت انتهای ریشه گوجه فرنگی تعلق داشت. وایت ابتدا از  محیط مصنوعی کشت شامل نمک های معدنی، عصاره مخمر و ساکارز استفاده کرد، و لی بعدا ( 1937 ) ویتامین های B، پیرودوکسین، تیامین و اسید نیکوتنیک را به جای عصاره مخمر به کار برد. محیط غذایی مصنوعی وایت یک محیط پایه برای کشت سلول و بافت تازمان مرگ او در سال 1968 پابرجا ماند. در دهه 1930 دوکشف مهم رخ داده بود:

الف- شناسایی اکسین به عنوان یک نوع تنظیم کننده طبیعی رشد  

ب - شناسایی اثر ویتامین های B در رشد گیاه.

در سال 1934 کاترت سلول های کامبیوم تعدادی از گونه های درختی را بر روی محلول نوپ حاوی گلوکز و سیستین هیدرو کلرید کشت کرده و اعلام کرد که آن ها پس از چند ماه تکثیر شدند. افزودن ویتامین B و IAA رشد کامبیوم را به میزان قابل توجهی ترقی می دهد. اولین بار کشت کامبیوم ریشه  هویج به وسیله گاترت در سال 1939 تداعی یافت. در همین سال وایت ( 1939 ) در آمریکا کشت بافت مشابه ای را از بافت تومور هیبرید توتون گزارش کرد. اگرچه کشت هایی در سال 1939 به طور مداوم انجام شده بود، اما این کشت ها موفقیت هایی را در کشت سلول های مریستمی شامل می شد. برای القای تقسیم در سلول های تمایز یافته و بالغ به کشف تنظیم کنندگان رشد دیگری نیاز داشت. اسکوک ( 1944 ) و اسکوک و تسویی ( 1951 ) ثابت کردند که در کشت بافت مغز توتون با افزودن آدنین و مقدار زیادی یون فسفات به محیط کشت غذایی آن موجب تشکیل و رشد کالوس شده و حتّی حضور IAA باعث تشکیل جوانه های رویشی می شود. ارزش سودمندی کاربرد روش های عاری از ویروس سازی، اولین بار توسط مورل و مارتین در سال 1952 برای اولین بار با تولید گیاهان عاری از ویروس از بوته های آلوده به ویروس به روش کشت بافت انتهای شاخه اثبات شد. این روش در زراعت و باغبانی مورد استفاده قرار گرفت. با این که ازاین روش برای تهیه و ازدیاد  بوته های عاری از ویروس گیاه زینتی ارکیده استفاده‌می‌شد، اما مورل در سال 1960 این روش را برای ازدیاد سریع این گیاه به‌کاربرد. به طوری که با استفاده از این روش از یک جوانه انتهایی به مدت یک سال 4 میلیون گیاه خالص ژنتیکی ( هموزیگوس ) تولید می شود(2). در غلات لورو(1949) در میان اولین غلات از جنین دانه ذرت کالوس تهیه کرد. در سال 1950 کشت بافت ریشه توسط فوجیوا تحقق یافت. در سال 1967برای اولین بار کشت بساک برنج توسط نی ای زیکی و اونو در کشور ژاپن انجام شد و مجله رسمی وزارت کشاورزی ژاپن آن را اعلام کرد. حدود 10 سال بعد دانشمندان چینی عملا آن را در تحقیقات برنج مورد استفاده قرار دادند. کشت بساک در مسیر ترقّی‌خود موجب‌توسعه‌تحقیقاتی در بیوتکنولوژی گردید که تحقیقات برنج را بیش از پیش توسعه داد (3).

خلاصه روش های گوناگون کشت بافت و کابرد آن در جدول زیر مورد اشاره قرار می گیرد:

نوع کشت	کاربرد
کشت جنین	کوتاه کردن دوره اصلاح نباتات، جلوگیری از سقط جنین، غلبه کردن بر ناسازگاری، تولید هاپلویید، منبعی برای تولید کالوس، تکثیر رویشی ( غیرجنسی)، رفع موانع جوانه زنی (1)، فراهم نمودن تولید انبوه گیاهان از لاین های الیت، سیستم بالقوه ای برای تولید بذور مصنوعی از طریق جنین زایی سوماتیکی، تغییر پذیری وسیع ژنتیکی به منظور تنوع سوماکلونال (2).
کشت مریستم	حذف پاتوژن ها ( ویروس ها، قارچ ها و باکتری ها )، تکثیر رویشی گیاهان نادر و گیاهانی که با زحمت و هزینه زیادی فراهم شده اند و احتمال ازبین رفتن آن ها وجود دارد، انتقال نمونه های عاری از بیماری ، جمع آوری ژرم پلاست.
کشت بساک و میکروسپور	تولید گیاهان هاپلویید، به دست آوردن انواع هموزیگوت در مدت زمان کوتاه، دست كاري ژنتیکی گیاهان (1)، افزایش کارایی انتخاب، برای تهیه لاین های خالص از نسل های در حال تفکیک، به دست آوردن لاین های پایدار و بارور از هیبریدهای با زیرگونه های مختلف، انتخاب مستقیم از موتانت، آمیزش های بین گونه ای، انتخاب نژادهایی از پاتوژن ها و یا بیوتیپ هایی از حشرات، ایجاد تعویض و اضافه نمودن کروموزوم های لاین ها از میکروسپور هیبرید های بین گونه ای و بین جنسی (2).
کشت تخمک و تخمدان	غلبه بر ناسازگاری، حفاظت از ریزش پیش از موعد، تلقیح تخمک در داخل لوله آزمایش، دورگ گیری غیر جنسی (1).
کشت پروتوپلاست	دورگ گیری غیر جنسی، به وجود آوردن سیبرید، انتقال ژن، ایجاد واریانت های ژنتیکی(2).

 

 

كشت بافت عبارت است از تغيير و تبديل اجزاء گياهي در شرايط رشد مصنوعي و گندزدايي شده مانندكشت ياخته، بافت، پروتوتوپلاست(protoplast) و اندام‌هاي گياهي ديگردر شرايط گندزدايي شده و در محيط غذايي مصنوعي در داخل لوله آزمايش. اكنون اين فناوري به عنوان يك روش پايه‌اي و يك ابزار محوري بسيار عالي در تكثير و اصلاح نژاد گونه‌هاي گياهي مهم اقتصادي موقعيت ويژه‌اي‌را كسب كرده است. كشت بافت گياهي در كشاورزي و باغباني نيز كاربردهاي عملي فراواني دارد. آزمايشگاه‌هاي ريزازديادي ساليانه ميليون‌ها نهال درختان و گياهان زينتي را توليد و به بازار عرضه مي‌كنند. كشت انتهاي شاخه يا مريستم به منظور توليد گياهان عاري از ويروس به طور گسترده‌اي در حال اجراست. كشت بساك، تخمك و همجوشي پروتوپلاست‌هادر به‌نژادي با كاهش مدت زمان لازم و افزايش كارايي انتخاب، سرعت عمل را زياد كرده است و علاوه بر اين روش خوبي در درك فرايندهاي ژنتيكي (Genetic)، فيزيولوژيكي (Physiology)، زيست شيميايي و زيست شناسي مولكولي به شمار مي‌رود. از طرف ديگر گياهان تراريخت كه از انتقال DNA خارجي به ياخته‌ها و پس‌از باززايي گياهي حاصل مي‌شوند، به سرعت در حال پيشرفت است  و تأثير اين محصولات در سلامت انسان در كشورهاي اروپايي و آمريكايي ترديدهايي را برانگيخته است.اگرچه دامنه‌ي چنين جنبش هايي به آسيا و آفريقا كشيده نشده است امّا به منزله‌ي هشداري براي همه‌ي ملل جهان تلقي مي گردد. اهداف اصلي اين تحقيق برمبناي تكوين گياهان تراژني مقاوم به حشرات، بيماري‌ها، خطر سرما و علف‌كش‌ها استواراست. همجوشي پروتوپلاسمي(ياخته‌هاي فاقد ديواره) امكان تلاقي بين گونه‌اي را مقدور مي‌سازد. اين روش براي تلاقي‌هاي بين گونه‌اي اهلي و وحشي اهميت زيادي دارد، زيرا نسل اول آن‌ها فاقد رويان تكامل يافته و غير قابل رويشند و گونه‌هاي وحشي معمولاً داراي ژن‌هاي كنترل كننده مقاومت به آفات و بيماري‌ها و شرايط محيطي مي‌باشند. علاوه بر اين در بعضي از روش‌هاي انتقال ژن‌ و تهيه پروتوپلاسم يك مرحله‌ي ضروري بوده و دريچه‌ي تازه‌اي در اصلاح نژادي گياهان زراعي گشوده است. جدول 1 روش‌هاي مختلف كشت بافت و كاربرد آن را نشان مي‌دهد(10 ).

          روش‌هاي كشت بافت مبتني بر دو مرحله تمايز زدايي و تمايزيابي مي‌باشد. ياخته‌ها، بافت‌ها و اندام‌هاي گياهي در طي مرحله تمايز زدايي، توده‌هاي ياخته‌اي بي‌شكل و متراكمي به نام پينه يا كالوس را توليد مي‌نمايند و سپس در شرايط غذايي و محيطي مناسب تمايز يافته و بافت‌هاي مختلفي را ايجاد نموده و گياهان كاملي را به وجود مي‌آورند. به همين دليل كشت بافت در مسائل مربوط به رشد و تمايزيابي تحت شرايط باز توليدي به آزمايش‌هاي گياهي كمك گرانبهايي كرده است. كشت بافت در كشاورزي و باغباني نه تنها به منظور تكثير گياهان بلكه اهداف مربوط به جذب مواد غذايي خاك، مقاومت به شوري خاك، حذف عوامل بيماري‌زا، حفظ ذخاير گياهي ارزشمند در كشت‌ها و در درجه حرارت‌هاي پايين و اصلاح گياهان كاربردهاي عملي بسيار وسيعي پيدا كرده است. اهميت كشت بافت گياهي به اندازه‌اي است كه بسياري از دانشگاه‌هاي دنيا آن را در دوره‌هاي آموزشي پيشرفته و مقدماتي خود گنجانيده‌اند و حتي در بعضي از كشورها دوره‌هاي تخصصي ريزازديادي را در سطح توليد سازماندهي كرده‌اند.

          نظريه بس‌تواني (Totipotency) كه در سال 1838 توسط شليدين و شوآن پيشنهاد شد، نيروي محركه‌ي اصلي توسعه‌ي اين شاخه‌ي زي فن شناسي (Biotechnology ) بوده است. بس تواني ياخته‌اي عبارت است از اين كه ياخته‌هاي گياهي در وظايفشان خود سازند و در اصل استعداد باززايي و توليد گياه كامل را در خود دارند. در ابتدا اين نگرش فقط در ياخته‌هاي تخم و هاگ تأييد شد. پس از گذشت مدت زمان طولاني براي ياخته‌ها‌ي بدني نيز به اثبات رسيد. بنابراين، بس‌تواني به عنوان يكي از ويژگي‌هاي ياخته‌هاي گياهي، توان بالقوه‌ي بزرگي در به دست آوردن نوتركيب‌هاي ژنتيكي محسوب مي‌گردد كه با صرف زمان و دشواري‌هاي بسياري با روش‌هاي به‌نژادي سنتي امكان‌پذير نبوده است. اكنون كشت بافت گياهي براساس چنين اصولي استوار گرديده و به سرعت در حال گسترش و ترقي مي‌باشد (3).

رواج و كارآيي بالقوه‌ي روش‌هاي كشت بافت در اصلاح نژاد گياهي عبارت است از:

1-تكثير گروهی.

2- حذف عوامل بيماري‌زا.

3- نگهداري ذخايرتوارثي به‌مدت زمان‌ طولاني.

4-توليد گياهان تك لاد (هاپلوييد).

5- ايجاد و انتخاب تغييرات ژنتيكي.

6- توليد محصولات ثانويه.

7- انتقال ژن.

8-دورگ‌گيري بين گونه‌‌‌اي و بين جنسي.

9- مهندسي ژنتيك- مولكولي گياهي(3).

جدول 1- روش‌هاي كشت بافت برحسب كاربرد و نوع کشت آن در تكثير و اصلاح گياهان (3) 

كاربرد	روش
گياهان تك لاد (هاپلویید) گياهان تك لاد گياهان تك لاد دورگ گونه‌هاي با فواصل نزديك و دور از نظر جنسي ناسازگار ريزازديادي سريع و حذف ويروس در گياهان ريزازديادي گياهان تغيير يافته‌ي مهم در كشاورزي تراريختي گياهي و توليد بذور مصنوعي توليد تركيبات شيميايي گياهي نگهداري دراز مدت منابع ژنتيكي گياهي گياهان مهندسي شده به روش ژنتيكي يا ترازايي	كشت بساك كشت ريزهاگ يا ميكروسپور كشت تخمدان بارور نشده كشت رويان و پروتوپلاست كشت مريستم كشت جوانه جانبي يا گره كشت سپرچه يا اسكاتولر تغيير ياخته‌هاي غيرجنسي كشت‌ياخته يا سوسپانسيون ياخته‌اي سرما نگهداري درون شيشه‌اي فنون بازتركيبي يا انتقال ژن

 تمايززدايي و باززايي

درسال‌هاي اخير، تلاش‌هاي تازه اي در برنامه‌هاي تحقيقاتي با هدف به‌كارگيري روش‌هاي مهندسي ياخته در اصلاح نژاد گونه‌هاي‌گياهي انجام يافته‌است. در مقايسه با روش‌هاي مرسوم كه به منظور توسعه گوناگوني هاي ژنتيكي توسط نوتركيب‌هاي ژن از طريق تكثير جنسي صورت مي گيرد، اين روش با شكستن موانع بين گونه اي، قادر به ايجاد گوناگوني هاي بسيار وسيعي شده‌است. به طور تخصّصي ترمي‌توان گفت كه اين روش مي تواند يك صفتي يا ژني را از جنس‌ها يا گونه هاي مختلفي انتقال دهد، در نتيجه مشكلات جدّي موجود در توليد مثل جنسي را بر طرف سازد. در اين فعّاليت‌ها، روش كشت بافت نقش بسيار با اهميّتي را برعهده دارد . كاربرد آن در اصلاح نژاد گياهي شامل استفاده از گوناگوني‌هاي با فراواني بالا به‌وسيله‌ي گياهان باززايي شده از كشت ياخته؛ انتخاب از طريق كشت ياخته هاي حاصل از تمايززدايي؛ وهمجوشي ياخته اي وروش DNA نوتركيب است . به هرحال، هنوز مسايل متعدّدي وجود دارد كه بايستي در هر مرحله پيش از به‌كار گيري عملي روش كشت بافت حل شود (10).

الف -  تمايززدايي

در سال 1838 ، شليدين و شوآن به‌طور مستقل از هم نظريه‌ بس‌تواني ياخته‌اي (Cell Totipotency)را پيشنهاد كردند و تعريف آن عبارت بود از : ياخته هاي گياهي در وظايف خود خودكارند و در اصل ، استعداد باززايي و توليد گياه كامل را در خود دارند. هم اكنون اين پيشنهاد علمي در مطالعات مربوط به كشت بافت گياهي يك اصل پايه اي شده‌است. اعتقاد بر اين است كه اوّلين كشت بافت گياهي در سال 1902 توسّط هاربرلنت با استفاده از ميان برگ (مزوفيل) و بشره برگ گياه ترادسكانتيا(Tradescantia ) انجام شده باشد كه باشكست روبرو گرديده بود. در حقيقت، اوّلين موفقيّت در كشت بافت در سال 1922 توسط كوتل يكي از شاگردان هابرلنت كه ريشه جوان نخود و ذرت را كشت داده بود، به اجرا در آمد . روبين(1922) با كشت ريشه جوان و محور زير لپه ترب آن را مورد تصديق قرار داد . هيچ‌كدام از اين آزمايش‌ها نتوانستند درمدت زمان طولاني پابرجا بمانند. در سال 1934وايت وگوآرت جدا از يكديگر اقدام به كشت ريشه كردند. علاوه بر اين ، گوآرت و همكاران از ريشه هويج، پينه هايي را توليد كردند. اين دستاوردها راه را براي توسعه بيشتر مطالعات كشت بافت هموار كرد. با اين وصف، تاجايي كه به القاي پينه و كشت گياهان تك لپّه اي مربوط است، هنوز مشكلات جدّيي وجود دارد كه بدون حل باقي مانده است (4).

اوّلين‌كار‌موفقيّت‌آميزالقاي‌پينه‌و‌واكشت(Subculture)گياهان‌در‌برنج‌توسّط‌فروهاشي و ياتازاوا در سال 1964 با القاي پينه از گره ساقه فراهم گرديد. آن‌ها در محيط غذايي بر پايه مواد معدني هلر(Gautheret-1959) كه محتوي 3 ميلي گرم گلايسين ، 60 ميلي گرم دي ال ـ تريپتوفان ، 5/0 ميلي گرم اسيد نيكوتنيك ، 5/0 ميلي گرم پيرويدوكسين، 5/0 ميلي گرم تيامين، 2 ميلي گرم توفوردي‌در هر ليتر و 5/0 % مخمّر، 2 % ساكارز و 6/0 % آگار بود، گره ها وريشه هاي جوان را كشت دادند. اين مواد در القاي پينه مؤثّر واقع گرديد . لازم به توضيح است كه پينه‌‌هاي گياهان تك لپّه اي عموماً با 2,4-D مي توانند توليد شوند(4).

      مايده (1965) اثر NAA و 2,4-D در القاي پينه از كشت بذور را آزمايش كرد. به اين ترتيب نشان دادكه در محيط غذايي محتوي‌2,4-D پينه توليد مي‌شود ولي NAA در آن تاثيري ندارد.او نتيجه‌گرفت‌كه براي‌القاي پينه‌وجود 2,4-D ضروري‌است و نيزيادآورشد، هنگامي كه همراه با 2,4-D از عصارة مخمّر استفاده مي شود رشد پينه تشديد خواهد گرديد. از اين گذشته، او ويژگي‌هاي ريخت شناختي هسته‌ي ياخته هاي پينه‌ي توليد شده و اثر كولشي سين در آن‌ها را نيز گزارش كرد. در ارتباط با ياخته هاي آزاد حاصل از پينه بذر، او مشاهده كرد كه اين ياخته ها گوناگوني هاي وسيعي از نظر شكل، شامل ياخته هاي مدوّر، زاويه دار، دراز و بزرگ، وموج داري را حايزند. اين ياخته هاي آزاد از نظر اندازه متغيّرند (جدول 1-1). در اين مورد، مايده (1967) پروره هاي مختلفي را از نظر تشكيل پينه مطالعه كرد. اودر 15 پروره‌ي برنج شامل انواع زيرگونه‌هاي ژاپني و هندي كه پينه تشكيل مي‌شد، تفاوت‌هاي معني داري رادر صفات ريخت شناختي، الگوي رشد و وزن تر مشاهده كرد.پينه بعضي از پروره ها افزايش سريعي در وزن تر، ساختار فشرده يا بافت كوچك و ترد را نشان مي‌دادند . علاوه بر اين، مشاهده‌هاي وي بر روي هسته‌ي ياخته ها، تفاوت‌هاي معني داري را در پروره هاي برنج نشان داد، كه عموماً ريخت زايي هسته‌‌هاي درشت با فراواني تقريباً 5/0 درصد همراه بود(10). تصویر شماره 3 بساک برنج را در حال تشکیل کالوس نشان می ده

جدول1- 1  اندازه‌ي ياخته‌هاي توليد شده دركشت سوسپانسيون ياخته اي پينه‌ي برنج  (مايده،1965).

نوع دانه برنج	طول(ميكرو متر)	پهنا(ميكرو متر)
متوسّط	9/17 - 1/41	4/7 - 8/18
حداكثر	2/114	0/50
حداقل	4/21	3/14

ب - تمايزيابي )باززايي‌گياه)

همان‌طور كه اشاره شد، تشكيل پينه در برنج با حضور 2,4-D امكان پذير مي گردد. از طرف ديگر، باززايي اندام‌ها و گياهچه هاي منفرد با كاهش غلظت 2,4-D يا جايگزين سازي آن با IAA  و NAA انجام مي شود. اين مطالعه ايجاب مي كند كه براي باززايي برنج هميشه وجود سيتوكنين ضروري نيست . مايده (1965) گزارش داد كه در انتقال پينه به محيط غذايي محتوي كينتين، 2,4-D و عصاره‌ي مخمّر، ريشه هاي نا بجا توليد مي شوند. نيش وهمكاران (1968) اوّلين كساني بودند كه در باززايي‌برنج موفقيّت كسب كردند. آنها بذور برنج را بر روي محيط غذايي Ls  با غلظت 10 – 5  مولار تو فور دي كشت كردند. پينه هايي كه از ريشه هاي جوان توليد شدند به محيط غذايي فاقد اكسين انتقال يافتند، به طوري‌كه در روشنايي باززايي‌كردند (جدول1 - 2).

  جدول1-2  تمايزيابي گیاهان در پينه برنج برروي محيط‌هاي غذايي فاقد اكسين (نيش و همكاران 1998).

نوع پينه	تعداد كل لوله آزمايش‌ها	تعداد لوله آزمايش‌هاي داراي ريشه (%)	تعداد لوله آزمايش‌هاي داراي شاخه (%)
اوّلين باززايي پينه (1)	9	(100) 9	(100) 9
دوّمين باززايي پينه (2)	21	(95) 20	(91) 19
سوّمين باززايي پينه (3)	14	(79) 11	(64) 9

توضيح: (1) زمان اولين شمارش يك ماه پس از انتقال کالوس،  (2) زمان دومين شمارش دو ماه پس از انتقال کالوس و (3) زمان سومین شمارش سه ماه پس از انتقال کالوس. 

 

قابليّت باززايي، معمولاً با تكرار واكشت‌ها كاهش مي يابد. اينو و مايده (1980) كاهش سرعت تشكيل اندام‌هاي مختلف و ناهنجاري‌هاي متعدّد گياهان باززايي شده را در مقايسه با بذورشان، از طريق كشت‌هاي پي‌درپي بررسي كردند. براي غلبه بر اين مشكل، اينو و مايده(1981) روش خاصّي را كه مشتمل بر دو مرحله كشت بود، مورد استفاده قرار دادند. محيط غذايي مرحله اوّل يا مرحله پيش كشت داراي اسيدآبسزيك بود، در حالي كه در مرحله دوم يا كشت پاياني، كينتين اضافه شده بود. آن‌ها گزارش دادند، چنين تركيبي تشكيل شاخه‌، ساقه‌ و برگ‌ها را به نسبت زيادي تشديد مي نمايد.آبه(Abe) و فوتسوهارا در سال 1984 آزمايش‌هايي را انجام دادند كه تشكيل ريشه از پينه و باززايي گياهچه برنج را در پروره‌هاي ژاپني و هندي و دورگ‌هايشان هدف قرار مي داد. نتايج نشان داد كه تفاوت‌هاي معني داري در اين گياهان از نظر فراواني باززايي وجود دارد: همه واريته‌هاي  ژاپني به خوبي باززايي كردند در حالي كه بعضي از ارقام زيرگونه هندي كاملاً با شكست مواجه گرديدند. از اين گذشته، بيشتر پينه‌هاي برنج باقابليّت باززايي‌كم، هنگامي كه در محيط غذايي باززايي كشت شدند در اثر بافت مردگي(Necrosis) از بين رفتند (10).

 از نتايج تحليل دورگ‌ها، تصوّر شد كه قابليّت باززايي ،يك نشانويژگي وراثتي است و توسّط ژن‌هايي هدايت مي شود. تاكنون پروره هايي وجود داشتند كه در ريخت شناختي پينه نيز مانند پاسخ به محيط‌هاي باززايي متفاوت بودند. بنابر اين تصوّر مي شد كه ممكن است آن‌ها ازنظر مقدار و موازنه هورمون‌هاي داخلي با هم تفاوت‌هايي داشته باشند و از اين راه تفاوت الگوي باززايي را در اين پروره ها موجب شده‌ باشد. در گونه‌هاي گياهان گندمه، معمولاً براي تشكيل اندام‌هاي نابجا (جوانه‌ها و رويان‌هاي نابجا ) روش باززايي خاصّي شناخته شده‌است. آن‌ها با اين آزمايش تشكيل رويان‌هاي نابجا را به‌خوبي مشاهده كردند(باززايي رويان هاي نابجاي دو قطبي داراي ريشه و جوانه تازه). درکولتیوارهاي ژاپني، عموماً تشكيل اندام‌هاي نابجا وقوع مي يافت. اگرچه آن‌ها همانندي اين دو روش باززايي را ملاحظه كردند امّا گاه‌گاهي اين‌ها به‌خوبي نمي توانستند تشخيص داده شوند. در پروره هاي هندي تشكيل نوعي رويان‌هاي نابجا و نمو آن در بعضي پروره ها مشاهده شد. اين تفاوت تشكيل پينه در ميان گونه هاي ديگر جنس اوريزا نيز گزارش شده‌است. تعداد نقطه‌هاي سبز، شاخه‌ها و ريشه‌ها در 20 ظرف كشت، 24 ساعت پس ازكشت پينه در محيط هاي غذايي اندام زا‌ يي تعيين شدند (10) . تصویر شماره 4 گیاهی را در حال باززایی از کالوس برنج نشان می دهد.

 جدول1-3  اثر واكشت‌هاي مكرر پينه‌هاي برنج در تشكيل اندام  (اينو و مايده،1980).

مراحل*	نقطه سبز	شاخه	ريشه
1	1180	68	4
2	580	5	19
3	250	1	8
4	150	1	2
5	100	0	5
6	40	0	1
7	27	0	0

                     * مراحل انتقال به محيط غذايي اندام زايي یا گیاه زایی

ج - رويان زايي نا بجا 

  قطع نظرازموفقيت در باززايي پينه برنج، آبه و فوتسوهارا (1986) درزمينه‌ي باززايي گياهان از سوسپانسيون ياخته اي نيز به مؤفقيّت‌هايي دست يافتند. بذور ضدعفوني شده برنج در محيط غذايي MS  با 2 ميلي گرم برليتر 2,4-D كشت داده شد. دو ماه بعد پينه‌ي حاصل به محيط كشت سوسپانسيون انتقال داده شد. سپس در محيط غذايي داراي 5/0 ميلي گرم برليتر كنيتين، 2گرم برليتر اسيد كازيين، 3 % ساكارز و بدون 2,4-D كشت شد. با اين روش كار، پينه رويان‌زاي متراكم و زرد كم رنگ و يا سفيدي حاصل شد. پس از كشت بر روي همان محيط فوق الذّكراين پينه‌ها رويان‌هاي نا بجايي راتوليد نمودند كه بعداً باززايي يافتند . آن‌ها  به نموّ رويان نابجا از پيش رويان به روش باززايي كشت سوسپانسيون به طور مستقيم قادر نبودند. با وجود اين، ثابت كردند كه رويان‌هاي نابجا حتّي از كشت دراز مدّت مطابق مراحل زير به طور موفقيت‌ آميزي مي‌توانند توسعه يابند: القاي پينه از بذور ضد عفوني شده، كشت توده هاي ياخته‌اي بر روي محيط‌هاي غذايي باززايي، القاي پينه رويان زا، و جابجايي مكرّر آن ها بر روي محيط باززايي (10) .

د - پينه رويان زا و نارويان زا

ياخته هاي كشت شده از نظر خواصشان با هم فرق دارند. اين شرايط داراي ارتباط نزديكي با مشكل نسبي باززايي گياهي برنج است. هيسر(Heyser) و همكاران(1983) پينه را به دو نوع رويان زا و نا‌رويان‌زا تقسیم بندی كرد‌ه‌اند. اما چنین پينه های رويان زایی مي‌توانند گياهان باروری را توليد كنند.درحالي‌كه، پينه نارويان‌زا، گاه‌گاهي، جوانه‌هايي را به وجود مي‌آورند كه نمي‌توانند ريشه‌دارشوند(جدول1-4) .

حتّي در كشت‌هاي 50 هفته اي نيز تقريباً 20% پينه هاي رويان زا ، جوانه توليد كردند. اين دو نوع پينه به وضوح مي توانستند از يكديگر تميز داده شوند: پينه رويان زا سفيد و متراكم، و داراي رويان‌هاي نسبتاً نموّ يافته بودند، پينه نارويان زا از زرد كم رنگ تا قهوه اي متغير بودند. همان طور كه در بالا اشاره شد، ياخته‌هاي كشت شده دو نوع پينه را شامل مي شوند:يكي پينه رويان زا كه قابليّت باززايي دارد و ديگري پينه نارويان‌زا كه باززايي آن به سختي وقوع مي يابد. به اين دليل، فرآيند باززايي در كشت بافت، اغلب با مشكلات شديدي مواجه است. در مورد اين كه آيا چنين روندي بر گشتي يا غير برگشتي رخ مي‌دهد، همواره پيشنهاد‌هايي وجود داشته است(10).

در اين زمينه، براي تشخيص پينه با قابليّت هاي باززايي بالا با استفاده از روش‌هاي زيست شيميايي، كوشش هايي صورت گرفته است. آبه و فوتسوهارا (1989) پينه انتخاب شده با قابليّت باززايي بالا و غير انتخابي آن را به روش تجزيه آيزوزايم پراكسيداز با هم مقايسه كردند. آن‌ها در نوارهاي بحراني تفاوت‌هاي معني داري را تشخيص دادند. علاوه بر اين ، با استفاده از الگوي نوار بندي پروتئين به وسيله PAGE ـ SDS (لايه يا صفح‍ة SDS) آن‌ها  فقدان نوار پلي پپتيدي داراي جرم مولكولي kd24 و kd42 را شناسايي كردند

جدول1-4  تعداد گياهچه هاي حاصل از 10 سانتي متر مكعب پينه پس از 5 هفته در چهار رقم برنج.

		تعداد نوشاخه‌ها‌ در10سانتي متر مكعب محيط غذايي
مراحل	نوع پينه	گيزا  159	IR36	ماشوري	پوكالي
دوّمين       سوّمين      چهارمين      پنجمين       ششمين	رويان زا نارويان زا رويان زا نارويان زا رويان زا نارويان زا رويان زا نارويان زا رويان زا نارويان زا	45/8 88/0 43/2 15/0 69/0 17/0 42/. 00/0 - -	42/3 29/0 61/8 00/0 0/14 09/0 0/11 16/0 9/11 00/0	2/25 94/0 8/23 00/0 81/6 83/2 4/13 46/0 41/9 75/0	02/0 40/0 68/7 00/0 11/3 18/0 41/3 15/0 - -

.

       اغلب در كشت ياخته‌اي گوناگوني‌هايي در كروموزوم‌ها رخ مي دهد. اين تفاوت‌ها ممكن است به علت گوناگوني‌هاي ريخت شناختي وكروموزومي در گياهان حاصل از باززايي باشد. سان و همكاران (1983) گياهان باززايي مشتق از پينه بذر و نسل هاي بعدي آن‌ها را در بيش از 2000 عدد، آزمايش كردند. آن‌ها دامنه وسيعي از گوناگوني هايي را مشاهده كردند كه نوع قد كوتاه را توسّط يك ژن منفرد مغلوب هدايت مي كرد، مانند: سبزدش‌هاي (كلروپلاست‌) غير طبيعي، گوناگوني در ارتفاع گياه، تعداد خوشه، وزن دانه و زمان رسيدن. انتظار مي رود اين گوناگوني‌هاي زادشناختي براي اصلاح نژاد گياهي سودمند باشد. هر چند، موانع زيادي وقوع اين گوناگوني‌ها را متوقّف مي‌سازد. تمايززدايي و باززايي دركشت ياخته ها براي همه‌ي بافت‌هاي گياهي و همه‌ي کولتیوارها و ارقام، هميشه كارآيي ندارند. اميد است با پيشرفت فعّاليت‌هاي تحقيقاتي در اين عرصه، استفاده مؤثّراز روش‌هاي كشت بافت گياهي در گسترش تنوّع زادشناختي امكان پذير گردد (9) .

 كشت انتهايي شاخه

    امروزه مطالعات فراواني در باره‌ي كشت انتهاي شاخه وجود دارد. تاناكا (1983) نشان داد كه با يك باردسترسي به گياه برنج هتروزيس براي تكثيربا استفاده از روش كشت انتهاي شاخه، مي توان از آن تعداد زيادي نشاء تهيّه كرد.

          ازمحيط پايه شامل محيط غذايي  B5پيشنهادي گامبورگ و محيط غذايي MS  به پیشنهاد موراشیج و اسکوگ استفاده شد. انتهاي شاخه به طول 5/0 ميلي متر از نشاهاي در حال رشد را قطع كرده و در 25 نوع محيط غذايي مختلف كه مطابق جدول 1-5 سيتوكنين و اكسين به آن‌ها اضافه شده بود، كشت گرديد. اين نوك شاخه‌ها در لوله‌آزمايش‌هاي به قطر 27 ميلي متر و طول200 ميلي متر كشت شدند و در معرض كشت دوراني با سرعت 2 دور بر دقيقه و درجه حرارت 22 درجه سانتي گراد قرارگرفتند. در طول كشت، شدّت نور در حدود1000تا2000 لوكس برقرارگرديد. يك ماه پس از كشت، توده هاي نخستين شاخه سبز رنگ به قطر 5 ميلي متر حاصل شد. در اين آزمايش با توجه به جدول1-5 محيط غذايي شماره 7 بهترين نتيجه را به دست داد. هرماه پس از اين كه توده هاي نخستين شاخه حاصل مي گرديدند، آن‌ها به‌نوبت به قطعاتي با قطر 4-3 ميلي متري تقسيم مي شدند و براي تكثير با همان شرايطي كه اشاره شد، در محيط هاي تازه كشت مي گرديدند (6).

 محيط غذايي شاخه زايي كه درتوليد گياهچه از توده‌هاي نخستين شاخه به كار مي رفت، يك محيط نيمه جامدي با pH برابر 8/5-7/5 در نظر گرفته مي‌شد. براي تهيّه اين محيط غذايي نيمه جامد، محيط B5 فاقد ساكارز را به نسبت 1 به 5 رقيق كرده و 20 گرم بر ليتر ساكارز و 8 گرم برلیتر ماده شیمیایی نيمه‌جامد‌كننده‌ آگار به آن اضافه گرديد. براي كشت، 80 ميلي ليتر از اين محيط غذايي را در داخل ارلن 300 ميلي ليتري ريخته و سپس يك توده نخستين شاخه به قطر 2-1 ميلي متر با دقت در آن كشت گرديد. اين كشت تحت شرايط حرارتي 20 درجه سانتي گراد و شدّت نوري 4000 لوكس نگاهداري گرديدند و براي اين كه اولين شاخه‌ها ظاهر شوند، در 16 ساعت روشنايي و 8 ساعت تاريكي قرار داده شدند. 2 تا 3 هفته پس از كشت، بنه ها(Corms) پديدار شدند و ريشه ها از مجاورت پايه ها ظاهرگرديدند. نشاء ها شروع به رشد كردند و پس از دو ماه كشت ساكن (Static) به ارتفاع حدود 70 ميلي متري رسيدند در مسير رشد و تكثيرشان، نوشاخه‌هاي نخستين برنج، اغلب اندام‌هاي پهن‌برگ مانندي را تشكيل مي دادند. در هر دو لايه، دانه‌هاي پلاستيدي مشاهده شدند، در هر حال سبزدش‌ها در لايه داخلي توسعه يافته تر از لايه خارجي بودند (10) .

نوشاخه نخستين مركب از دولايه بود: يك لايه‌ي خارجي با يك رديف از ياخته هاي منفرد و يك لايه‌ي داخلي چندين ياخته‌اي داراي بافت نرم. ديواره ياخته‌هاي لايه خارجي ضخيم‌تر از لايه داخلي بود. تكثيرگياهچه‌ها خيلي سريع انجام شد: افزايش سرعت تعداد درهرماه 5 برابر ماه پيش مي گرديد، يعني در سال بالغ بر 14/2 ضربدر 10 به توان 8 گياه‌بود. معني آن اين است،  يك گياه اوليه مستعد توليد بيش از 240 ميليون گياه درسال است(10) .

زمینه ژنتیکی كشت انتهايي نو شاخه برنج

 وانگ (1987)كشت انتهايي شاخه برنج هاي وحشي O. rufipogon O. perennis,  , O. nivara , , O. sativa X O. latiforia F1, O. sativa X O. perennis F1, O. sativa X O. rufipogon F1, O.atiforia به اضافه دو زيرگونه‌ي‌ برنج زراعي هندي و ژاپني را بررسي كرد. تقريباً در همه مواد حاصل از كشت انتهاي شاخه( حدود 2/0 ميلي متر طول) در ششمين مرحله برگي عمل تمايزيابي رخ داد. در نتيجه تأثيرگذاري زمينه ژنتیکی تشكيل جوانه‌ي گل در گياهان باززايي شده ، ميزان تشكيل جوانه گل در برنج وحشي بيشتر از برنج زراعي بود و سرعت آن در ارقام هندي عمومأ بيشتر از ژاپني شد. تجزيه تركيبات اصلي محيط‌هاي غذايي مورد استفاده در اين كشت‌ها نشان داد كه زآتين در شتابدهندگي تشكيل نخستين خوشه تأثير بسزايي دارد، در حالي كه اسيد آبسزيك ظاهراً تمايز خوشه را شتاب مي‌دهد. در ضمن معلوم شد كهNH₄)₂SO₄ ) از تمايز خوشه‌ها جلوگيري به عمل مي آورد(10) .

كشت بساك ياگرده نارس

تا سال 1968 كه براي اوّلين بار گياهان تك لاد توسّط" ني اي زيكي و اونو" از كشت بساك برنج توليد شد ، تحقيقي انجام نشده بود. بعد از آن، هم در ژاپن و هم در كشورهاي ديگر براي توسعه اين شاخه از علم تحقيقاتي انجام يافت . مطابق گزارش گردهمايي كشت بساك در سال 1978 و نيز مقالاتي كه توسّط شن و همكاران (1983)، شن (1986) و اكسو (1988) به چاپ رسيد مي توان پي برد كه مطالعات گسترده‌اي در چين انجام شده‌است . در اين نوشته، بيش تر از منابعي استفاده خواهد شد كه توسّط شن در سال 1978 نگارش يافته است.

جدول1-5 نتايج كشت انتهايي شاخه برنج در محيط هاي غذايي با تركيبات مختلف اكسين و سيتوكنبن (ميلي گرم بر ليتر)  (تاناكا،1983).

	سيتوكنين		BAP		K
	اكسين	0	125/0	2	125/0	2
	0	1 شاخه‌ها	6      مرده	11      مرده	16  مرده	21 مرده
	NAA               25/0	2 پينه‌ها	7 شاخه نخستين	12 شاخه نخستين	17 ـ	22 ـ
	NAA                 1	3 پينه‌ها	8 شاخه نخستين	13 مرده	18 ـ	23 ـ
	2,4-D             25/0	4 مرده	9 شاخه نخستين	14 شاخه نخستين	19 پينه‌ها	24 پينه‌ها
	2,4-D              1	5 مرده	10 پينه‌ها	15 مرده	20 مرده	25 پينه‌ها

   توضيح: محيط پايهB5 و هورمون‌ها شامل)  NAAاسيد آلفا- نفتالن استيك ) و 2,4-D (اسيد 2،4-دي كلروفنوكسي استيك) و BAP ( 6- بنزيل آمينوپورين) و K ( كينتين).

 فرآيند باززايي گياهي در برنج

    پيش از توليد تك لاد برنج ، با استفاده از تاتوره و توتون گياهان تك لادي حاصل گرديده بود. در اين گونه‌هاي گياهي، از ريز هاگ‌ها، رويان‌هايي تهيّه گرديد و سپس از آن‌ها گياهچه هايي باززايي شدند. در رابطه با گياه برنج، معلوم شد كه گياهچه‌ها از پينه‌ي حاصل از ريزهاگ‌ها تمايز مي‌يابند(10). سپس اين فرآيندكه به موجب آن ريزهاگ‌ها از راه پينه، گياهان تك لاد را توليد مي كنند براي بسياري از گونه هاي گياهي به كار رفت. اگرچه در گياه برنج دنبال كردن چنين روندي كه با ريزهاگ آغاز و با رويان‌ها ادامه مي يابد و سپس تك لادها توليد مي گردند، رسميّت يافته است (شن وهمكاران،1982) امّا سرعت عمل آن بسيار كم مي باشد(10).

نقش كشت بافت در توسعه تحقيقات برنج نويسنده: فردوس عادلي مسبب

 

عوامل مؤثّر در القاي پينه‌

1 -  مرحله نموّ گرده و زمان جمع آوري خوشه گرده و گياهچه

 يكي از مهم ترين عوامل مؤثر در توليد تك لادها از پينه‌ي بساك، مرحلة نموّي گرده در بساك‌هايي است كه براي كشت به كار مي روند. ني اي زيكي و اونو در سال 1971 براي اوّلين بار گزارش دادند كه يك مرحله خاصّي يا مرحله گرده هاي تك هسته‌اي در كشت بساك مؤثّر است(جدول 1-6). محققان ديگري در اين موضوع بيشتر تلاش كردند و توضيح دادند كه با تقسيم مرحله گرده تك هسته‌اي، فراواني القاي پينه در اوايل اين مرحله 6/5 % است. اين فراواني در اواسط تك هسته اي 7/35 % رخ مي دهد و در اواخر مرحلة تك هسته‌اي به 5/10 % مي‌رسد. درحالي‌كه اين فراواني در مرحله ميتوز اوّل 7/6 % تخمين زده مي شود و در دو مرحلة دو هسته اي و چهارتايي(تتراد) به صفر درصد كاهش مي يابد(شن 1977). در مورد مرحله رشدي بطوري كه خوشه‌ها محتوي بالاترين فراواني گرده ها در مراحل اواسط تا اواخر تك هسته اي باشند، بوته هاي برنج داراي چنين خوشه هايي را مي توان به وسيله اشكال زير تشخيص داد: طول بين گوشواره‌هاي برگ پرچم و برگ ما قبل 7-5 سانتي متر، رنگ پوشينه گلچه ها سبز روشن، وطول پرچم به اضافه ميله‌ي پرچم به اندازه نصف تا يك سوّم طول‌گلچه باشد. لازم به توضيح است كه اين عوامل در کولتیوار‌ها و شرايط كشت مختلف متغيّر است(8).

جدول 1-6 فراواني بساك‌هايي‌كه توليد پينه كرده اند

مرحله نموّ ياخته هاي زايشي	تعداد بساك‌هاي كشت شده	تعداد بساك‌هايي كه پينه توليد كرده اند	فراواني (%)
ياخته هاي پيش هاگ	130	0	0
ياخته‌هاي‌مولدگرده يا تترادها (چهارتايي‌ها)	297	0	0
گرده هاي تك هسته اي	3012	279	3/9
گرده‌هاي‌دوهسته اي يا رسيده	2180	0	0

 2 -  شرايط فیزیولوژیکی و رشد و نموّ منابع‌گياهي

هو و همكاران، در سال1978نشان دادندكه‌در شرايط گوناگون رشد گياه برنج، درجه حرارت مهم‌ترين عامل آن است زيرا در فراواني القاي پينه وباززايي گياهچه تأثير به سزايي دارد. رشد گياه برنج در مزرعه ( Ċ20 - 18 ) توليدپينه و باززايي زيادترگياهچه‌ها را نسبت به كشت آن‌ها در گلخانه(Ċ  28 - 26) نشان مي دهد.

3 -  زادمون(ژنوتيپ)

قابليّت كشت بساك در گونه‌ها، زيرگونه‌ها و ارقام به‌طور معني داري متفاوت است. در برنج زراعي، ارقام گلوتيني(چسبناك) به داشتن بالاترين قابليّت كشت شناخته شده اند. ارقام برنج از نظر پاسخ به كشت بساك به اين ترتيب هستند: برنج گلوتيني <  ژاپني < دورگ ژاپني×هندي < دورگ برنج هندي × هندي < هندي. فراواني القاي پينه برحسب اين كه چنين کولتیوار‌هايي به كدام يك از زير گونه هاي هندي يا ژاپني تعلّق داشته باشند، تفاوت زيادي دارد. در مقايسه‌ي برنج وحشي اوريزا پرنيس و زراعي اوريزا ساتيوا، عموماً ملاحظه گرديد كه فراواني القاي پينه در اوّلي كمتر از دوّمي است.

      فراواني توليد گياهچه سبز نيز در ميان کولتیوار‌ها بطور معني‌داري متفاوت است. قابليّت بالاي تمايزيابي گياهچه‌ي سبز از پروره هاي بومي آساهي(Asahi) و جينبوزوشوسي (Ginbozuchusei) وراثتي است(ساساكي، 1986). از طرف ديگر، اثر سيتوپلاسم در فراواني باززايي گياهچه سبز نيز جاي تأمّل دارد(جدول 1-7 ).

 در تلاش‌هايي كه براي شناخت علل اين تفاوت در قابليّت كشت بساك انجام يافت، تعدادي از تركيبات اسيد هاي آمينه در بساك‌ها، استقرارريزهاگ‌ها در مراحل اواسط و اواخر تك هسته اي، در ميان زيرگونه هاي هندي، ژاپني و دورگ‌هاي هندي× ژاپني مورد مقايسه قرار گرفت.نتايج نشان داد كه مقدار آلانين در بساك‌هاي ارقام هندي پايين تر از بقيّه است. تاًثير آلانين با آزمايشي كه نشان مي داد القاي پينه با افزايش آن به محيط غذايي كشت بساك به طور قابل ملاحظه اي تشديد مي يابد، مورد تأييد قرارگرفت (زوو و همكاران 1983).

جدول 1-7  اثر سيتوپلاسم در فراواني باززايي گياهچه هاي سبز

تلاقي‌ها	فراواني گياهچه‌هاي سبز (%)
تايچونگ 65* اوريزا پرنيس × تايچونگ 65	6/13
اوريزا پرنيس * تايچونگ 65 * تايچونگ 65	5/5

پيش‌تيمار هاي بساك‌

 تيمار درجه حرارت پايين(سرمادهي)

مطابق گزارش محققين متعددي، تيمار درجه حرارت پايين خوشه ها پيش از جمع آوري بساك‌ها در تشديدكنندگي القاي پينه و تمايزيابي گياهچه ها تأثير زيادي دارد. بنابر اين، در حال حاضر چنين پيش تيماري به صورت يك روند ضروري در كشت بساك در آمده است. مدّت زمان اين پيش تيمار با پايين آوردن درجه حرارت ( Ċ 5-3) كوتاه تر مي گردد. به عبارتی، در درجــه حرارت بالاتر ( Ċ 15-10)، دوره پيش تيمار طولاني تر مي شود. براي کولتیوار‌هاي ژاپني، تيمارآن‌ها در  Ċ 5 به مدّت 7روز در مقايسه با پيش تيمار  Ċ10 به مدّت 10 روز يا Ċ 13 به مدّت 14-10 روز تاًثير بيش تري دارد.به هرحال، براي کولتیوار‌هاي هندي، پيش تيمار Ċ 5-3 به مدّت 10 روز،  Ċ 8-6 به مدت 15-10 روز يا Ċ 10-9 به مدت 20-15 روز قابل بررسی است. مدّت زمان بهينه پيش تيمار درجه حرارت پايين برحسب مواد به كاررفته متفاوت است. عموماً، با زياد شدن مدّت زمان پيش تيمار، تمايزيابي گياهچه هاي سبز با فراواني كم تري رخ مي دهد كه در نتيجه وقوع گياهان زال ( Albino) بيش تري را به دنبال خواهد داشت.

          علّت اين كه چرا پيش تيماردرجه حرارت پايين در القاي پينه و تمايز يابندگي گياهچه ها تأثير مي گذارد هنوز ناشناخته مانده است. معمولاً، اعتقاد بر اين است كه پيش تيمار درجه حرارت پايين باعث مي‌شود تا بيش ترين تعداد ريزهاگ‌ها به مرحلة تك هسته اي برسند. در نتيجه، پيش تيمار درجه حرارت پايين، تنفّس ريزهاگ‌ها و مصرف مواد غذايي در آن‌هارا كاهش مي دهد، بنابراين، عمر بساك‌ها طولاني مي گردد و براي نموّ دانه‌هاي گرده شرايط مناسبي فراهم مي شود (زاوو ، 1983).

 تيمار بامواد شيميايي

افزايش بعضي ازاسترها به محيط‌هاي غذايي، فراواني القاي پينه را افزايش مي دهد (هو، 1978). پس از اين كه بساك‌ها به مدّت 4 روز در محيط  غذايي مايعي كه داراي 250-50 ميلي گرم بر ليتر كولشي سين است كشت شدند، فراواني پينه و تمايزيابي گياهچه‌ها‌ي سبز افزايش يافت، و ميزان توليد دولاد (Diploid) به 79% رسيد. درصورتي‌كه تيماري انجام نشود اين فراواني 8/53 % خواهد بود. هنگامي كه غلظت كولشي سين به 500 ميلي گرم بر ليتر برسد،  فراواني القاي پينه و تمايزيابي گياهچه سبز درنتيجه‌ي افزايش زالي، كاهش خواهد يافت(هو و ليانگ،1979).

تركيبات محيط كشت

محيط پايه: باتوجّه به محيط هاي غذايي القاي پينه و محيط هاي پايه، انواع متعدّدي از آن‌ها استفاده شده اند: مطابق پيشنهاد شن (1976، جدول 1-8) بعضي از اين محيط هاي غذايي براي زيرگونه هندي و بعضي ديگر براي ژاپني مؤثّر واقع مي گردند.

محيط غذاييN6

 

 چو وهمكاران-1975- اين محيط غذايي را براي كولتيوارهاي ژاپني مناسب دانستند. نمك‌هاي معدني، به‌ويژه يون‌آمونيوم، در رشد و القاي پينه تأثير دارد. هنگامي كه غلظت آن‌كم تر از 7 ميلي مولار باشد، تشكيل پينه‌ي گرده تشديد مي گردد، در حالي كه با غلظت‌هاي زياد آن نقصان مي يابد. بهترين نتيجه هنگامي به دست مي آيد كه غلظت (NH₄ )₂ SO₄   و KNO₃  به ترتيب 35 و 28 ميلي مولارباشند.

محيط غذايي He5

هانگ و همكاران-1987- اين محيط را براي كولتيوارهاي هندي پيشنهاد كردند. هنگامي كه غلظت يون NH₄ از مقدار مناسب 5/3 ميلي مولار تجاوز كند، فراواني القاي پينه به‌سرعت كاهش خواهد يافت.

محيط غذايي SK3

اين محيط غذايي توسط شن وهمكاران- 1978براي دورگ‌هاي هندي × ژاپني تهيّه شده‌است. ارزش نسبت [NH₄ ] / [NO₃] در SK3 برابر با11/0 مي باشد كه ميانگين بين 16/0 درN6 و 07/0 در He5 است. هنگامي كه نصف نمك معدني N6 با تركيبات آلي MS آميخته شد، براي ژاپني و نسل اوّل ژاپني  هندي نتايج بسيار خوبي حاصل گرديد.

محيط غذايي براي تمايزيابي گياهچه:

تعداد زيادي گزارش نشان مي دهد كه محيط‌هاي محتوي مقدار زياد نمك معدني در تمايزيابي گياهچه مؤثّر است. مناسب‌ترين محيط غذايي براي ارقام زيرگونه ژاپني MS و براي هندي XM-2 مي باشد.

غلظت ساكارز:

 ساكارز به منظورتأمين منبع كربن و تنظيم فشار گذرندگي(اسمزي) به محيط غذايي افزوده مي شود. اگر چه غلظت آن در محيط غذايي القايي پينه معمولاً 3 % است، غلظت 6 % آن در تمايزيابي گياهچه هاي سبز تاًثير بيشتري دارد. هنگامي كه غلظت ساكارزدرمحيط به بالاتر از 9 % برسد، پينه هايي القا مي يابند كه به توليد تعداد زيادي گياهچه زال منتهي خواهندشد

.

هورمونهاي خارجي

براي زيرگونه‌ي ژاپني مقدار 2 ميلي گرم بر ليتر 2,4-D رايج ترين كاربرد را دارد. استفاده از 10 ميلي گرم بر ليتر2,4-D فراواني القاي پينه را افزايش مي دهد، امّا فراواني تمايزيابي گياهچه را كاهش مي دهد. اگر اثر NAA در تشديدكنندگي القاي پينه بيشتر از2,4-D باشد، تمايزيابي گياهچه مي توانددر محيط القايي محتوي چنين هورمون‌هاي خارجي رخ دهد. تاكنون فراواني تمايزيابي گياهچه سبز از پينه اي كه در محيط محتوي NAA توليد شده باشد بالاتر از پينه حاصل از محيط محتوي 2,4-D ملاحظه نشده است. براي زيرگونة هندي سطح بالاتري از هورمون‌ها لازم است. اخيراً در چين، بطور فزاينده‌اي از هورمون‌هاي چندگانه استفاده شده‌است. براي زيرگونه  ژاپني، محيط محتوي 4 ميلي گرم بر ليتر NAA ، يك ميلي گرم برليتری2,4-D و 3-1ميلي گرم برليتر KNمؤثر شناخته شده است، در حالي كه تركيب 2 ميلي گرم برليتر NAA ، 2ميلي گرم برليتر 2,4-D و 3 ميلي گرم برليتر KN   براي هندي بيشترين تاًثير را داشته است(10) .

 

جدول 1-8  محيط هاي پايه‌ای كه معمولاً براي كشت بساك برنج استفاده مي شود(ميلي گرم بر ليتر)

محیط                   تركيبات	N6	SK3	He5	MS	XM-2
نيترات پتاسيم	2830	2830	3181	1900	1900
نيترات آمونيوم				1650	4950
سولفات آمونيوم	463	315	231
فسفات دي هيدروژن پتاسيم	400	640	600	170	510
كلرور كلسيم دو آبه	166	166	166	400	440
سولفات منيزيم هفت آبه	185	280	35	370	370
اتيلن‌دي آمين تترا استيك اسید	3/37	4/64	5/74	3/37	5/74
سولفات آهن هفت آبه	8/27	1/48	5/55	8/27	5/55
سولفات منگنز چهار آبه	4/4	4/4	4/4	3/22	3/22
سولفات روي هفت آبه	5/1	5/1	5/1	6/8	6/8
اسيد بوريك	6/1	6/1	6/1	2/6	2/6
يدور پتاسيم	8/0	8/0	8/0	8/0	8/0
سولفات مس پنج آبه				025/0	025/0
موليبدات سديم دو آبه				25/0	25/0
كلرور كبالت شش آبه				025/0	025/0
اينوزيتول				100	100
گلايسين	2	10	2	2	2
تيامين	1	5/0	6/0	4/0	1
پيرودوكسين	5/0	5/0	6/0	5/0	5/0
اسيد نيكوتينيك	5/0	5/2	3	5/0	5/0

 

مكمّل‌هاي آلي :

براي آزمايش اثر به كار بردن مواد آلي به عنوان مكمّل محيط القايي تمايزيابي مطالعاتي انجام شده‌است. مواد آلي مورد استفاده عبارت بودند از : شير نارگيل، عصاره آبي استخراجي سيب زميني، شير درون دانه (Endosperm) غلاّت، پروتئين آب كافت شده (Hydrolysis) و اسيدنوكلئيك آب كافت شده . نتيجه به دست آمده از اين آزمايش‌ها تا اندازه اي سردرگم و متناقض بوده است. به هر حال، لازم به توضيح است كه مطابق گزارش‌هايي يك گرم برليتر عصاره‌ي مخمّر ، 500-250 ميلي گرم برليتر لاكت‌آلبومين هيدروليزات،200-20 ميلي گرم برليتر اسيدنوكلئيك آب‌كافت شده در تمايزيابي گياهچه سبز تاًثير دارد(شن و همكاران،1974).

 

محيط غذايي سيب زميني :

هنگامي كه 50-20 % محلول استخراجي سيب زميني به جاي همه تركيبات محيط غذايي اسنفاده شد، كارآيي آن در تمايزيابي بيش‌تر از MS نگرديد. اين كاهش ممكن است به دليل پايين بودن مقدار مواد معدني آن باشد، زيرا مواد معدني بازدهي توليد را بهبود مي بخشند )شانگ و همكاران،1978) . درميان تــركيبات موجود در محلول استخراجي سيب زميني، اسيدآبسزيك (ABA ) به عنوان يك هورمون خارجي اثر كرد، در حالي كه بقيّه بي تاًثير بودند .

 

كشت هاي تعليقي(سوسپانسيون) در محيط هاي غذايي مايع

 هنگامي كه كشت بساك در محيط مايع و با استفاده از كولتيوارهاي ژاپني انجام شد، دانه هاي گرده با شكافته شدن بساك‌هاي شناور در مايع، توليد پينه نمودند. در صورتي كه بساك‌ها در محيط مايع شناور باشند، معمولاً پينه‌ها سريعتر تشكيل مي شوند. اگرچه پينه ها پس از القا از نظر تعداد بيشتر از آن‌هايي هستند كه در محيط نيمه جامد آگاري به دست آمده اند، چنين پينه هايي در مقايسه با پينه هايي كه از كشت بساك در محيط نيمه جامد حاصل مي شوند از نطر قابليّت تمايزيابي ضعيف‌ترند. از اين گذشته، توضيح اين نكته ضروري است كه پينه‌هاي شناور درمحيط مايع داراي قابليّت باززايي بالاتر از آن‌هايي هستند كه غوطه ورند. كشت در محيط غذايي مايع يقيناً مؤثّرتراز كشت در محيط نيمه جامد نيست. باوجود اين، براي القاي جهش‌يابي يا خالص كردن جهش يافته ها مي توانند به كار برده شوند. اخيراً نجيشي و همكاران(1987) گزارش دادند كه فراواني بالاي باززايي گياهچه به روش كشت شناور بساك تحقق يافته است. آن‌ها در آزمايش‌هايشان مؤفق به باززايي گياهچه ها به ميزان صد درصد در هر بساك شده اند.

 

پديده‌ زالي‌(آلبينو)

 زال‌ها فاقد سبزينه در گياهان باززايي شده از گرده ها به فراواني مشاهده مي شوند. وقوع زالي به ژنوتيپ بستگي نزديكي دارد. كولتيوارهاي هندي و دورگ‌هاي هندي/ ژاپني به توليد زالي‌هاي بيش‌تري نسبت به ژاپني تمايل دارند. حتّي درميان كولتيوارهاي ژاپني نيز در اين مورد تفاوت‌هايي وجود دارد ( تصوير 6).

 

 

جدول1-9 اثر تغيير درجه حرارت در وقوع زالي ها (وانگ و سان 1978).

تيمار زمان تأثير درجه حرارت(C )	تعداد كل گياهچه ها	تعداد گياه سبز	درصد گياه سبز	تعداد زالي	درصد زالي
دوروز در C 35  چهار روز در  C 35  شش روز درC 35  هشت روز در C 35  دوازده روز در  C 35  شاهد  Ċ26  سه روزدر C 26  چهار روز در C 26  شش روز در C 26  هشت روز در C 26  شاهد در Ċ 35	58 12 48 48 115 172 114 137 98 173 230	3 2 18 20 62 87 36 21 9 8 6	2/5 7/16 5/37 7/41 9/53 7/50 6/31 3/15 2/9 6/4 9/2	55 10 30 28 53 85 78 116 89 165 204	8/94 3/83 5/62 3/58 1/46 3/49 4/68 7/84 8/90 4/95 1/97

 

تأثير محيط غذايي

 استفاده از هورمون NAA نسبت 2,4-D فراواني توليد بيش‌تر زالي‌ها را به دنبال دارد، امّا غلظت زياد 2,4-D (20 ميلي گرم بر ليتر) سبب مي شود تا همه گياهان زال گردند(وانگ  و همكاران، 1977). غلظت كم آهن عامل ديگري در ايجاد زالي‌هاست. افزايش گياهان سبز متناسب باغلظت يون آهن دو ظرفيتي است. تا جايي كه به اثر ساكارز مربوط مي شود، نتايج ضد و نقيضي به دست آمده است: در بعضي از گزارش‌ها نشان داده شده‌است كه زالي‌ها اغلب هنگامي بروز مي يابند كه غلظت ساكارز به جاي 3 تا 6 % ، به مقدار 9 % به كار رفته باشد. به هر حال، بستگي هاي ديگري را در اين زمينه نمي‌توان ناديده انگاشت(10).

 

درجه حرارت كشت بساك

اگردر حين كشت درجه حرارت محيط به 30 درجه سانتي گراد برسد، بيش‌ترين پينه‌ها گياهان زال را توليد مي‌كنند. بالارفتن درجه حرارت 8 ساعت پس از كشت بساك بيش‌ترين حسّاسيت را در پديداري زالي‌ها دارد(وانگ و سان 1978،جدول 1-9). هنگامي كه خوشه‌ها پيش از كشت در درجه حرارت 26 تا 35 درجه سانتي گراد به مدّت 5-3 روزپيش تيمار شوند، همه‌گياهان حاصل از باززايي از پينه، زال خواهند بود. تصویر 6 گیاه آلبینو ناشی از افزایش درجه حرارت رادر مقایسه با یک گیاه سبز طبیعی نشان می دهد (10).

 

تصویر 6 - مقایسه گیاه آلبینو ناشی از افزایش درجه حرارت در مقایسه با یک گیاه سبز طبیعی

 

مشاهده ازطريق ميكرسكوپ الكتروني

 پينه هايي كه گياهچه‌ي سبز را توليد مي كنند با بافت‌هاي مريستمي متراكم و نيز مقادير بالاي تركيبات موجود در ياخته ها مشخّص مي شوند. اين ياخته ها مدوّر يا تخم مرغي شكل هستند و ديواره ياخته اي آن‌ها كاملاً موجدار است. در مقابل، پينه هايي كه زالي هارا توليد مي كنند داراي ساختار بافت درشت هستند و مواد كمي در ياخته هاي آن‌ها وجود دارد. ديواره هاي ياخته اي آن‌ها به طور محسوسي منحني شكل هستند(10).

 از تجزيه RNA ريبوزومي (rRNA) در گياهچه‌هاي سبز معلوم شد كه 25 نوع RNA قابل حل(rRNA) و sRNA 18يا ريبوزوم سيتوپلاسمي و sRNA  23و  sRNA 16يا ريبوزوم‌هاي پلاستيدكه هردو در rRNA آن‌ها وجوذدارند. به هرحال در گياهچه هاي زال فقط sRNAs ريبوزوم‌هاي پلاستيد مشاهده شد(10).

          وقوع زياد گياهچه‌هاي زال حاصل از كشت در درجه حرارت‌هاي بالا ممكن است به علّت تغييرات ساختاري ياخته هاي زير هاگ‌ها باشد كه در مرحله كشت اوليه رخ مي دهد. همچنين ممكن است به علت بعضي از تغييرات زيست شيميايي باشد كه در حين نرزايي پيش مي آيد. به‌علاوه، تخريب پلاستيد به عنوان پاسخي براي پيدايش زالي ها پذيرفته شده‌است (11). تفاوت زيرگونه‌هاي برنج هندي و ژاپني در نياز به تيمار سرمايي هم به زادمون و هم به حالت فيزيولوژيكي آن‌ها بستگي دارد. در برنج تيمار سرمايي 8 درجه سانتي‌گراد به مدت 10- 8 روز، پينه زايي و توليد گياهان تك لاد را به طور قابل ملاحظه‌اي افزايش داده و از ميزان گياهان زال كاسته است(4).

 

توليدگياه هاپلوئید از پروتوپلاست‌‌هاي دانه‌‌گرده

توري زاما و هيناتا (1986) پينه بساك را در يك محيط غذايي AA با استفاده از تركيبات اسيد هاي آمينه به عنوان منبع نيتروژني كشت دادند. آن‌ها سوسپانسيون ياخته‌اي را تهيّه كردند كه بعداً از آن پيش دش‌ها (پروتوپلاست) جدا شدند. نظر به اين كه سوسپانسيون ياخته‌اي در محيط AA به سرعت تكثير مي‌يابد، تعداد زيادي پروتوپلاست توليد شد. اين‌پروتوپلاست‌‌ها براي توليد پينه هاي داراي ساختار متراكمي كه از آن‌ها گياهچه هاي سبز باززايي مي شود (24 %) در محيط محتوي نيترات به عنوان منبع نيتروژني كشت شدند. از 15 گياهچه‌اي كه تا مرحله گلدهي رشد كردند، 3 گياه تك لاد و بقيّه آن‌ها دولاد بودند.       

 

كشت بساك و وراثت گياهان مشتق از گرده

اثر متقابل بافت‌هاي‌گرده دربافت‌هاي ديواره‌ي بساك

گياهچه‌هاي ناشي از گرده برنج‌هاي زيرگونه ژاپني علاوه بر تك لاد(هاپلوئيد)، شامل دو لاد(ديپلوئيد)، سه لاد(تريپلوئيد)، چهار لاد، پنج لاد و بي هولاد (آنوپلوئيدي) هستند. پنج لادها توسّط نيشي و ميتسوكا (1969) و واتانب(1974) به روش كشت بساك حاصل گرديدند. گزارش‌هاي ديگري در باره‌ي توليد پنج لادها به اين روش‌در جاي ديگري ديده نشده اند. جدول 1-10 مثالي از فراواني پيدايش سطوح لادي‌مختلف‌گياهان‌گرده‌اي  را نشان ميدهد(10).

 جدول1-10 سطح لادي گياهان گرده‌اي برنج (شن و لي ، 1978)

سال آزمايش	تكرار كولتيوارها و تلاقي‌ها	تعداد تك لاد	درصد تك لاد	تعداد دولاد	درصد دولاد	تعداد پر لاد	درصد پرلاد	تعداد كل گياهان‌گرده‌اي
1972 1974 1975 1976 1977	8 13 3 9 13	23 120 183 237 186	1/41 6/45 1/32 0/47 2/28	31 133 350 249 424	4/55 6/50 4/61 3/49 3/64	2 10 37 19 50	5/3 8/3 5/6 7/3 6/7	56 263 570 505 660

 

اين فراواني‌ها با سن پينه، غلظت هورمون‌ها و شرايط كشت تغيير مي كند . ارقام زير گونه هندي بر خلاف ، ژاپنـــي پرلادهاي(پلي پلوئيدي) ‌بيش‌تري (4/42 %)  را نسبت به تك لادها (8/12 %) و دو لادها (0/41 %) توليد مي كنند(ليانگ و همكاران، 1978).

بي هولادهايي‌ ( آنوپلوييد ها )كه تشخيص داده شدند عبارت بودند: از سه تني هاي اوليه (1+ n 2)، سه تني‌هاي دوتايي(1+1+ n2)، چهارتني‌ها(tetrasomic) (2+ n 2)، تك تني ها (1- n 2) و بي تن ها(nullisomic) (2- n 2) ، ( چو و زانگ، 1985) (10).

      تشخيص اين امر ضروري‌است كه‌آيا‌دو‌لادهاي فوق از گرده مشتق شده‌اند يا از بافت‌هاي ديواره‌ بساك. نظر به اين كه دولادهاي مشتق از بافت‌هاي بساك از لحاظ عملي و نظري داراي اهميّت اندكي يا فاقد ارزش هستند، شناسايي آن‌ها مهم است. در مورد گياهچه‌هاي باززايي حاصل از روش كشت بساك گياهان دورگ، آن‌هايي كه منشأشان از گرده است در نسل‌هاي بعدي داراي ظاهر ريخت شناختي برابري هستند. از طرف ديگر، اگر دو لادها از ديواره‌ي بساك‌مشتق شده باشند، ظاهر ريخت شناختي آن‌ها در نسل‌هاي بعدي تفكيك پذير خواهد بود. علاوه بر اين، برعكس گرده ها، بافت‌هاي ديواره‌ بساك مستعد توليد پينه نيستند (ني اي زيكي و اونو، 1971) . كينوشيتا (1982) نشانويژگي‌هاي گياهچه‌هايي (تك لادها و دو لادها ) كه از راه كشت بساك گياهان F₁  حاصل از تلاقي‌ 10 آزمون‌كننده مختلف داراي 5-3 ژن نشاندار را مورد مطالعه قرار دادند. با اثبات اين كه همه‌ اين آزمون‌كننده ها مي‌توانند در يك گرده منفرد پيدا شوند ، او استنتاج كرد كه تمام گياهچه ها قطع نظر از سطوح لاديشان از ريزهاگ‌هاي با خاستگاه بساك زاده شده اند (10).

گوناگوني‌ها و تفرّق نشانويژگي‌ها

 هموزیگوزیتی تک لادهاي دوبرابر(دابل‌هاپلوييد)

اين كه آيا گياهان دو لاد مشتق از گرده تثبيت يافته اند يا تفرقه دارند، نياز به تأييد است. تعداد كل 484 لاين R2 كه از كشت بساك گياهان F1 حاصل از تلاقي بين نيپون بار و كويين- جانك- بانگ به دست آمد، هردو والد از زيرگونه ژاپني بودند. از ميان اين گياهان 434 خط (90%) از نظر كليّه نشانويژگي‌هاي مختلف يكنواخت بودند، در حالي كه 50 خط ديگر(10%) ازنظر عقيمي دانه و اختصاصات ريخت شناختي تفرقه داشتند(شن،1986).از مطالعات ارقام هندي توسّط تانگ (1978) و بررسي هاي شن نتيجه گيري شد كه 90 درصد دولادهاي حاصل از دو برابرشدن طبيعي، هموزيگوسند (Homozigosity). بررسي زيستايي گياهان جورتخم از نقطه نظر ژنتيكي مورد علاقه اصلاح كنندگان گياهان بوده است. در مورد زيستايي گياهان گرده اي حاصل از دورگ‌هاي F1 تاكنون گوناگوني و اثر تخريبي تشخيص داده نشده است(10).

 وقوع گوناگوني‌ها در حين كشت

       رويدادهاي جهشي تك لادها نسبت به دو لادها با فراواني بيش‌تر و قابليّت تشخيصي آسان‌تري هستند. گوناگوني‌هايي كه به دقّت اوليه بيش‌تري نيازدارند عبارتند از: زودرسي و ديررسي، ساقه كوتاه و ساقه بلند و عقيمي كم. به‌علاوه، در ريشك‌ها، تعداد پنجه‌ها، طول خوشه‌ها، تعداد دانه‌ها در خوشه و افزايش دانه در خوشه نيز جهش رخ مي دهد. به وجود آمدن گياهان كوتوله (Dwarf  plants) زياد هم دور از انتظـار نيست. تغيير رنگ، جهش سبزينه، ريزش برگ، بسته زامي ( Cleistogamy) و لكّه برگي نيز مي توانند مشاهده شوند.

 قابليّت باززايي ميكروسپور‌ها در زادمون‌هاي گوناگون

       نظر به اين كه ميكروسپورهاي گياهان F1 از تركيبات گوناگون ژن‌هاي گياهان مادري منشأ مي گيرند، بنابر اين زادمون‌هايشان متنوّعند. در اين صورت لازم است آزمايش شود كه آيا ريزهاگ‌ها در آزمايشگاه داراي استعداد برابري براي تكوين به گرده هستند يا خير؟ به عبارت ديگر، بايستي مشخّص شود كه آيا كارآيي انتخاب در روند كشت وجود دارد يانه. نتايج آزمايش‌هاي زيادي نشان داده است كه ميكروسپور‌هاي ژنوتيپ‌‌هاي (Genotype) مختلف، از لحاظ هردو صفت كمّي و كيفي داراي قابليّت برابري در تمايزيابي گياهچه‌ها هستند. مطالعه ديگري در مورد كشت بساك گياهان F1 دورگ هندي × ژاپني نشان داد كه در چند حالت تمايزيابي ژاپني يا يك نوع بينابيني آن بيش‌تر از هندي است (شن و همكاران 1978)(10).

 تفرّق صفات در نسل‌هاي گياهان گرده‌اي و علل‌آن

 همان طوركه بيان گرديد، نزديك 10% گياهان گرده اي در زاده هايشان تفرقه دارند. اين تفرّق  مربوط است به : (1) نشانويژگي‌هاي باروري ، (2)نشانويژگي‌هاي ريخت شناختي، (3)هردو نشانويژگي‌هاي باروري و ريخت شناختي، و (4)تفرّق مطابق آنچه  در F2 تحقّق مي يابد. براساس نتايج حاصل از تحقيقات لي و همكاران (1978) حالت (1) حدود 30 % ، حالت (2) برابر 20 % ، حالت (3) بيش از 50 % و حالت (4) نيز به ندرت رخ مي دهد.دلايل امكان تفرقه نشانويژگي‌ها عبارتند از:

تغيير در تعداد كروموزوم‌ها و ساختار آن: بي هولادها ، كژزادها (Chimeras) يا دورگ‌هاي ساختاري ممكن است سبب اين تفرقه صفات و باروري شده باشند.                           

 توليد گياهان گرده اي از ميكروسپور‌هاي غيرتك‌لادي: گياهان دورگ از ميكروسپور‌هاي غير تك لاديي توليد شده باشند كه در آن دوره‌ي تقسيم نا منظّم ياخته اي مولّد گرده انجام يافته باشد.

جهش ژني: اگردر حين كشت، وقايع جهشي يك ژن منفرد يا چندين ژن پيش از دو برابر شدن وقوع  يابد، مي تواند پاسخي براي تفرقه‌ي صفات R2 يا H2 باشد.

 

كاربرد كشت بساك در اصلاح برنج

 اهميّت كشت بساك

 كوتاه سازي مدّت زمان زادگيري: استفاده از كشت بساك در تلاقي ارقام برنج به تسريع عمل تثبيت دورگ كمك مي كند. معمولاً پايدار شدن خط‌ها 7 -5 نسل به طول مي انجامد. در كشت بساك، براي تثبيت يك خط سپري شدن دو نسل مي تواند كافي باشد. كشت بساك به‌ويژه در نلاقي‌هاي دور مؤثّر شناخته شده‌است(10) .

 افزايش بازدهي انتخاب: گياهچه‌هايي كه از ميكروسپور‌هاي تك لاد منشأ مي گيرند، فنوتيپ‌هايشان مطابق ژنوتيپ‌‌هاي تك لاد دوبرابرشان است. از اين‌رو، بروز فنوتيپي ژن‌هاي مغلوب، بوسيله ژن‌هاي غالب مخفي نگهداشته نمي شود. بازدهي انتخاب در زادگيري كشت زياد مي شود، به طوري كه اين انتخاب مي تواند در ميان هموزيگوت‌ها انجام شود. امّا در زادگيري دودماني (Pedigree)، گياهان و خط‌هاي انتخابي هتروزيگوتند(4).

 كاربردهاي زادگيري جهشي: جهش يافته‌هايي كه در شرايط معيني انتخاب شده اند، در گياهان تمايز يافته بي‌درنگ خودرا آشكار مي سازند.

 مقايسه‌ي زادگيري بين روش‌هاي دودماني و كشت بساك

  بازدهي اين دو روش زادگيري مورد مقايسه قرار مي‌گيرد (جه و همكاران 1983). دراين آزمايش از 4 خطّ براي مقايسه استفاده شد: دو تا از آن‌ها از 200 لاين F1 – F 5 كه به روش زادگيري دودماني حاصل شده بودند، انتخاب شدند، و دو خط ديگر از 17 خط H2 كه به روش كشت بساك فراهم گرديده بودند. تقريبأ در ميان 4 خط انتخابي هيچ‌گونه تفاوت معني داري از نظر ميانگين ارتفاع گياه، طول خوشه، تعداد دانه در خوشه و طول برگ پرچم تشخيص داده نشد. با اين وجود، ضريب تغييرپذيري لاين‌‌هاي حاصل از كشت بساك كوچك‌تر از لاين‌‌هاي زادگيري دودماني بود. با اين وصف، در چين تخمين زده شد كه براي معرّفي يك كولتيوار جديد برنج از راه زادگيري تك لادي يك دوره‌ي زماني پنج ساله لازم است. به منظور استفاده مفيد از روش كشت بساك در زادگيري عملي، توجيه اندازه جمعيّت لاين‌هاي تك لاد دوبرابر را به طور نظري مي توان محاسبه كرد. به اين ترتيب ثابت شد كه 10 ژن متفاوت از يكديگر فنوتيپ‌‌هاي مادري هستند كه در اولين تلاقي مورد استفاده قرار مي گيرند، حد اقل اندازه جمعيّت با انواع نوتركيبي كامل  1024 تخمين زده مي‌شود. به هرحال، در برنامه‌‌هاي زادگيري عملي در چين 100 گياه گرده اي كافي تشخيص داده شده است. در حقيقت ، تعداد كل كولتيوارهاي برنج بجمعيت‌هاي مشتق از گرده  برابر با 100 يا كمتر بود. براي مثال، Zhong-hua-1 از 71 لاين توليد شده و Zhong-hua-8, 9 از 40  لاين انتخاب شده‌اند(10).

 كاربرد كشت بساك در اصلاح برنج به روش دورگ‌هاي دور

در چين گياهان دورگ از طريق تلاقي برنج با Reeds ، ذرّت خوشه اي و چوب خيزران (Bamboo) به دست آمد. كه مشكلات بزرگي در پايدارسازي آن‌ها وجود داشت. به هرحال در مطالعات كشت بساك چنين دورگ‌هايي، تعدادي خط‌هاي تثبيت يافته حاصل گرديده است(سانگ1978،گروه زادگيري تك لادي،آكادمي علوم كشاورزي گوآنگ دانگ، 1978)(10).

 كاربرد كشت بساك در زادگيري دورگ‌هاي هندي× ژاپني  

به منظور تنوّع پذيري منابع ژنتيكي‌و افزايش‌گوناگوني‌هاي‌آن از راه دورگ گـيري هندي × ژاپني و در نتيجه ترافرستي‌ژن‌هاي ضدآفات و بيماري‌هاي زيرگونه هندي به ژاپني با استفاده ازكشت بساك ميسّر گرديد. در واقع، پيدايش عقيمي زياد در گياهان دورگ، تفرقه شديد در بيش از چندين نسل، يا دو قطبي شدن صفات به انواع نامتناهي امكان وقوع دارد. به اين دليل، به دست آوردن انواع بينابيني برتر خيلي مشكل است. ميزان بذرنشيني گياهان نسل اول دورگ‌هاي هندي × ژاپني به روش پس تلاقي‌دهي(تلاقي برگشتي)  36-26 % و 50-45 % بوده است، اما هنگامي كه اين لاين‌‌ها كه به روش كشت بساك توليد شدند، به 80 % رسيد.

 اصلاح كولتيوارهاي جديد

          از سال 1975 در چين با استفاده از كشت بساك كولتيوارهاي جديدي توسعه يافت. در اين روش، بيش‌تر از گياهان نسل اول دورگ‌هاي ساده استفاده شد. مطابق گزارش شن و همكاران (1983)، تا اين‌سال 28 پروره به روش كشت بساك، معرّفي شده اند. درميان اين كولتيوارها، Xin-Xiu و Wang-Keng به ترتيب در 300000 و 530000 هكتار كشت مي‌شدند(10).

 كشت بساك برنج‌هاي دورگه(هيبريد)

 اهداف مهم ديگر استفاده از كشت بساك براي زادگيري برنج عبارتنداز برانگيختن بساك‌هاي گياهان دورگه با دگرينگي قوي (هتروزيس) از نظربازدهي محصول. كشت بساك‌ فرصتي ايجاد مي كند تا كولتيوار‌هاي پرمحصول جديدي نظير برنج‌هاي دورگه توسعه يابد. در ميان‌كولتيوار‌هاي تازه اي‌كه به روش

 جدول1-13. نشانويژگي‌هاي‌كولتيوار‌هايNan you2   و Nan- hua 5 , 11  (شن و همكاران، 1983)

كولتيوارها	دوره‌ رشد   (روز)	تعدادخوشه برمتر مربع	تعداد دانه در خوشه	پوكي (%)	وزن هزار                   دانه‌ (g)	ميزان محصول (t/ha)	ميزان افزايش محصول
Nan- hua 5	122	249	132	9/30	0/26	25/7	5/22
Nan-hua 11	137	267	111	1/18	2/28	92/6	9/16
Nan-you 2	124	183	159	8/47	5/26	92/5	0

توضيح:Nan- hua 5 وNan- hua 11 از راه كشت بساك و Nan- you 2 نسل اولIR24*Er jiu NaN IA  خالص گرديده اند.

 

كشت بساك فراهم گرديده اند،از Nan-hua 8 ، 11 Nan-hua و 22 Nan-hua را مي توان نام برد(جدول1-13) كه از باززايي برنج‌هاي دورگه زير حــــاصل گرديــــده اند: Nan- you2, Shan- hua7701 , 7706 , 78-1, 793 , 792 , 791  از Shan – you 2 و Yin – hu 2 ازYin – you 2 به طور كلّي، ثابت شد كه ميزان محصول آن‌ها بالاتر از كولتيوار‌هاي نمونه‌ي محلّي است.

 وارد كردن ژن‌هاي بيگانه

معلوم شده‌است، وارد كردن اسيد هاي نوكلئيك به ياخته هاي برنج همان عملي را انجام مي دهد كه يك پروتئين خارجي در چنين ياخته‌هايي بر عهده دارد (نيو و همكاران 1979).در روندكشت بساك برنج، بساك‌هايي كه مدّت 24 ساعت در درجه حرارتC   4 در يك محيط پايه محتوي mRNA سويا، به صورت غوطه‌ورسرمادهي‌شدند، 20-15 روز پس از كشت، پينه ها پديد آمدند و باززايي گياهچه ها وقوع يافت. در اثر تيمار اين گياهچه ها با كولشي سين، گياهان دو لاد حاصل‌شدند و در نتيجه بذر توليدكردند. با يك آزمايش معلوم شد، بوته‌هاي برنج حاصل از اين بذورمحتوي پروتئين سويا هستند. بديهي است در صورتي كه تيماربا mRNA سويا انجام نشود، در بوته هاي برنج پروتئين سويا ص داده نخواهدشد(10) .

نقش کشت بافت در توسعه تحقیقات برنج

كاربرد جهش‌زايي در اصلاح برنج

1- جداكردن جهش يافته ها دركشت بساك

 با اين كه نشانويژگي‌هاي متعددي نظير ارتفاع گياه، زمان رسيدگي و وزن دانه را در آزمايشگاه نمي توان مجزّا نمود، اما انتخاب جهش يافته‌هايي كه بطور طبيعي در مرحله‌ي رشد ياخته ها يا پينه‌ها رخ مي دهند، امكان پذير است. با آزمايش همه‌ي بوته هاي تمايز يافته، جهش يافته هاي با ساقه‌ي كوتاه و زودرس انتخاب شدند. با استفاده ازاين روش كار، ياخته هايي كه استعداد تحمّل  تنش‌هاي معيني را دارند، مي توانند شناسايي گردند. تاكنون جهش يافته هاي مقاوم به 5-متيل تريپتوفان، نمك و كادميوم شناسايي شده اند.

 2 - پرتو دهي با اشعه‌ي گاما

پرتودهي خوشه‌هاي برنج پيش از گلدهي با اشعه‌ي گاماي حاصل از  Co 60 ( با  R 2000 – 1000) و سپس با كشت بساك آن‌ها ، تشكيل پينه و باززايي گياهچه تشديد مي گردد و  جهش‌هايي در ارتفاع گياه، زمان رسيدن و باروري بذر انجام مي گيرد.

 3- تيمار با مواد شيميايي جهش زا

          مواد شيميايي جهش دهنده مانند، اتيلن ايمين (EI) ، اتيل متان سولفونات (EMS)،‌1-متيل-3-نيترو-1-نيتروزوگوآنيدين (MNNG) به كار برده  مي شوند. تيمار با اين جهش دهنده‌ها پيش از كشت بساك انجام مي شود. جهش يافته هايي كه به اين ترتيب حاصل مي گردند، مربوط به زمان رسيدگي،‌ ارتفاع گياه،‌ توانايي پنجه دهي و باروري بذر هستند(9).

كشت گرده مجزّا

در كشت بساك، ريزهاگ‌ها مواد غذايي خود را از بافت‌هاي ديواره‌ي بساك در يافت مي كنند و از اين رو وابسته به آن هستند. اين فقط به بخش محدودي از ريزهاگ‌ها مربوط است كه نرزايي در آن رخ مي دهد.

 براي موفقيّت در كشت گرده هاي جدا شده برنج،‌‌‌‌‌‌ بساك‌ها پيش از كشت به مدّت چند روز در درجه حرارت پايين پيش تيمار(سرمادهي) مي گردند و سپس گرده ها جدا مي شوند. هنگامي كه بساك‌ها تنها به مدّت يك روزتيمار شدند،‌ در گرده هاي مجزّا چندين بار تقسيم رخ داد. ولي همه اين گرده ها دير يا زود رو به نابودي نهادند. بساك‌هايي كه به مدّت 3-2 روز سرمادهي گرديدند،‌ گرده هاي چندياخته اي را توليد كردند، كه برونه پوش(اگزين) آن‌ها پاره نمي شد. سرمادهي به مدت زمان 5 روز سبب شد تا بساك‌ها به يك توده چند ياخته‌اي يا پينه نموّ يابند. تقسيمات هاگ‌گياه (اسپوروفيت) در طول مرحله تيمارپيش‌ازكشت تحقّق يافت. باكشت گرده هايي كه از بساك‌هاي با 10 روز تيمارجداشده بودند، پينه و گياهچه هاي سبز حاصل شدند. از همراه كردن تيمار درجه حرارت پايين به مدّت 15-10 روز و پيش كشت بساك به مدت 4-3 روز بهترين نتيجه به دست آمد. با اين تيمار ها، در اغلب گرده ها پيش از اين كه آن‌ها از بساك‌هايشان جدا شوند،‌‌ 4-2 بار تقسيم ريزهاگ‌ها وقوع يافت. پس از كشت، اين گرده ها و ريزهاگ‌ها به توده هاي ياخته اي و پينه‌ها نموّ يافتند.

در گياه برنج،‌ نرزايي ريزهاگ‌ها ازداخل بساك شروع مي شود و تنها گرده هايي كه نرزايي را شروع كرده اند مستعد تكوين بيشتري از راه كشت گرده هاي مجزّا مي باشند. بافت‌هاي ديواره‌ي بساك به طور قطعي در شروع نرزايي ريزهاگ‌ها در ابتداي كشت بساك نقش زيستي مهمّي را برعهده دارند. درابتداي مرحله نموّ، رويان‌هاي مشتق از گرده توسّط يك ساختار بند مانند يا لوله مانندي به ديواره بساك اتّصال دارند. در مرحله پينه، اين ساختار داراي چندين لايه‌ي ياخته اي است كه به ديواره بساك چسبيده است.

همان طوركه در بالا اشاره شد، وظيفه‌ي بافت‌هاي بساك در برانگيختگي نرزايي مرحله‌ي آغازي كشت بساك داراي اهميت ويژه اي است. به طور خلاصه تر مي توان گفت كه بافت ديواره‌ي بساك در دوره‌ي تمايززدايي، دانه هاي گرده با ذخاير غذايي اصلي را توليد مي كنند و آن‌ها مواد غذايي موجود در محيط مصنوعي را جذب، ذخيره و تغيير شكل مي دهند و به عنوان ذخاير متابوليكي گرده‌ها درخود نگاهداري مي نمايند(زانگ و ليانگ ، 1980). كشت متوالي از راه شناور كردن بساك‌ها براي جداسازي مكانيكي گرده به منظور اجراي هردو مرحله‌ي القاي پينه و باززايي گياهچه هاي سبز مناسب تشخيص داده شده است(9) .

 در پينه هاي توليد شده به روش كشت گرده هاي مجزّا  و كشت بساك بر روي محيط نيمه جامد، تفاوت‌هاي قابل توجّه اي وجود دارد. پينه هاي اولي از نظر شكل منظّم، داراي ساختار نرم و ياخته هاي بزرگ با پيش پلاست اندكي هستند.نه‌تنها آن‌ها مستعد پيري و مزگ نيستند، بلكه قابليّت تمايزيابي خودرا به سادگي از دست نمي دهند. اگرچه كشت گرده هاي مجزّاي برنج موفقيّت آميزبوده است، در اين روش فراواني القاي پينه هنوز پايين‌تراز روش‌كشت بساك مي باشد. علاوه براين موانع و مشكلات زير نيز در گرده مجزا مشاهده شده‌است:

1-در اجراي كشت گرده مجزّا، روش‌هاي مؤثّر توليد منابع ريزهاگ‌هاي تك هسته اي هنوز توسعه نيافته است.

2 - پينه هايي كه از راه كشت گرده توليد مي شوند، داراي مشكلات متعددي مانند تمايزيابي پايين و پيدايش گياهان زال فراوان هستند(10).             

 كشت جنين و تخمدان

كشت جنين، روشي‌است‌كه در آن جنين نارس قطع شده از تخمدان در شرايط گندزدايي در يك محيط غذايي مايع يا نيمه جامد رشد داده مي شود. از سال 1930 تا 1940 هنگامي كه دامنه‌ وسيعي از گونه هاي گياهي براي كارهاي عملي به كار مي رفت، اين فنّ نيز توسعه يافت. به دليل تمايل به نارس ماندگي جنين يا اضمحلال درون دانه(آندوسپرم) در دورگ گيري دور مانند تلاقي بين گونه اي، كشت جنين نارس ضروري است. يكي از كاربردهاي كشت جنين، كوتاه كردن دوره زادگيري(به‌نژادي) به ويژه تسريع جوانه زني در بذوري است كه به‌سختي جوانه دار مي شوند. علاوه بر اين، كشت جنين براي تحليل عوامل مؤثّر جنين زايي نيز مورد استفاده قرارگرفته است(5).

 تا پيش از سال 1950 از كشت جنين براي گياه برنج استفاده نمي شد. علّت اين تأخير روشن نيست. تصوّر مي شود كه در دورگ گيري بين گونه اي گياه  برنج ،كشت جنين ضروري نبوده است، زيرا در آن رويان زايي سريع انجام مي شود و حتّي درمواقعي كه تجمّع نشاسته در درون دانه پايين باشد، با بذرپاشي دقيق مي توان نشاء تهيّه كرد. در حقيقت، تعداد گزارش‌هاي موجود مربوط به كشت جنين برنج خيلي كم است.

كشت تخمك كه در آن تخمك‌هاي نارس بارور شده قطع و برروي محيط غذايي نيمه جامد كشت گرديددر سال 1960در دانشگاه دهلي نو و ساير مؤسسات رواج يافت. اين فنون اساساً براي مطالعه‌ي نموّ بذر مورد استفاده قرار مي گرفت. اين روش‌ها براي تهيّه گياهان دورگ بين گونه‌اي در حالتي كه رويان‌ها در مرحله اوليه نمو ازبين مي رفتند به كار برده مي شد(ناكاجيما، 1988). در گياه برنج ، كشت تخمدان عملي نيست، زيرا جدا كردن آن خيلي مشكل است. بنابر اين، كشت تخمدان براي به دست آوردن دورگ‌هاي بين گونه اي هرگز استفاده نشده است.

از پايان سال 1970 ، براي القاي تك لادهاي(هاپلوييد) تخمك زاد يا ماده‌زاد از گامتوفيت‌هاي ماده در جو، گندم، ذرّت، توتون و آفتابگردان به روش كشت تخمك و تخمدان‌هاي بارور نشده، تلاش‌هاي زيادي صورت گرفته است. توليدگياهان تك لاد برنج با اين روش در چين نيز انجام شده‌است(10) .

نقش كشت بافت در توسعه تحقيقات برنج- ارائه دهنده پروژه: فردوس عادلی مسبب

كشت جنين

آمه‌مياوهمكاران(1956) در باره‌ي كشت رويان نارس گياه برنج از سال 1950 مطالعاتي را آغاز كردند. آن‌ها 18كولتيوار، كه انواع ديم، آبي، چسبنده (برنج‌هاي باآميلوز بسيار كم يا بدون آن و  آميلو پكتين زياد كه پس از پخت دانه ها به هم چسبيده و از هم جدا باقي نمي مانند، اين نوع برنج ها را واكسي نيز مي گويند) و غيرچسبتده پس از پخت(برنج هاي با آميلوز بيشتر از 18 % كه پس از پخت، دانه ها جدا از هم باقي مي مانند و به برنج هاي غير واكسي(waxy) معروفند) زيرگونه هاي برنج هندي و ژاپني‌را براي آزمايش‌هاي خود مورد استفاده قرار دادند. در اين آزمايش‌ها، آن‌ها موفّق شدند از رويان‌هاي 10 روزه گياهان كاملاً بالغي را به دست آورند.

در اين دوره زماني، فنون مورد استفاده در كشت بافت به اندازه كافي توسعه نيافته بود و اطلاعات لازم در باره تركيب محيط غذايي وجود نداشت. علاوه برآن، دامنه محيط‌هاي غذايي مصنوعي قابل استفاده نيز محدود بود. بنابر اين آمه ميا و همكاران(1956) از محيط غذايي وايت استفاده مي‌كردند(1943، جدول 1-14). رويان‌هاي نارس همه‌ي پروره ها و سويه ها، كه در محيط‌هاي غذايي با 8/0 % آگار كشت شده بودند، پس از دوروز سبز شدند. به علّت سبزشدن زود هنگام، نشاء ها در ابتدا ضعيف بودند، امّا بعداً رشد توان‌مندي در آن‌ها نمودار گرديد و به گياهان بالغ توسعه يافتند.

 تحليل تطبيقي تأثير تركيبات نيتروژني در ميان نمك‌هاي معدني معلوم كرد كه نمك‌هاي آمونيوم مؤثّرتر از نمك‌هاي نيتراتي در سطح بهينه 01/0 مولار است. ويتامين‌هاي (B1 ، B6 و اسيد نيكوتينيك) در محيط غذايي وايت براي رشد رويان مؤثر نيست و به‌ ويژه براي رشد گياهچه ها كارآيي لازم را ندارند. نتايج آزمايشي اثر گلايسين و اسيدهاي آمينه ديگر در محيط غذايي وايت نشان داد كه بيشتر اسيدهاي آمينه رشد گياهچه را متوقف مي سازند.

درباره اثر كربوهيدرات‌هاي گوناگون در رشد رويان مطالعات زيادي انجام شده‌است. از ميان قندهاي ساكارز، گلوكز و فروكتوز بيشتر از همه ساكارز با غلظت 2 % در رشد گياهچه تأثير دارد. كربوهيدرات‌هايي كه به محيط‌هاي غذايي اضافه مي شوند از يك طرف با فراهم كردن مواد غذايي باعث تشديد رشد گياه مي گردند، از طرف ديگر آن‌ها با افزايش فشار گذرندگي (اسمزي) از اين رشد ممانعت به عمل مي آورند. تصوّر مي شود كه بهترين شكل استفاده از اين كربوهيدرات‌ها بستگي به موازنه بين اين دو كاركرد درآن ها دارد.

غلظت زياد قند، فشار گذرندگي  را در محيط‌هاي غذايي بالا مي برد، كه از جوانه زني پيش رس جلوگيري مي كند ولــي رشد روياني(رويان زايي عادي) در رويان‌هاي نارس را تشديد مي نمـــايد(ناكا جيما، 1972). در اين آزمايش غلظت زياد هيدروكربورها، تعدادبرگ اوليه را در رويان‌هاي نارس افزايش نداد.

اثرات مواد رشد گياهي مانند اكسين‌ها و مواد غذايي شامل عصاره ها و كازيين هيدروليزات مورد آزمايش قرار گرفت و نتايج آن‌ها نشان داد كه غلظت پايين IAA و كازيين هيدروليزات رشد نشاء (دانه رست) را شتاب مي دهد.

          در يك تحقيق، نشان داده شد كه رويان‌هاي بارورشده 10 روزه مي توانند در محيط غذايي وايت با 2 % ساكارز و 8/0 % آگار كشت و اين كشت‌ها در 30 درجه سانتي گراد در تاريكي به مدّت 5 روز نگاهداري و سپس به روشنايي انتقال يابند. آمه ميا و همكاران (1956) براي تعيين شرايط كشت به منظور بالا بردن كشت رويان‌هاي خيلي جوان و نارس كوشش‌هاي زيادي به عمل آوردند. در جهت اين خواسته يك سري آزمايشات شامل افزودن كازئين هيدروليزات به محيط غذايي وايت انجام شد. آن‌ها دوگروه از پروره ها را مورد استفاده قراردادند: پروره هاي زودرس كه گلدهي آن‌ها در فصل گرم رخ مي داد، و پروره هاي ديررس كه گلدهي آن‌ها در فصل سرد وقوع مي يافت. نشان داده شد كه رويان‌هاي 6 روزه اولـي و 9 روزه دومي هر دو مــي توانند به گياهان كامل نموّ يابند(جدول1-15).

 

جدول 1-14. تركيب محيط غذايي وايت بر حسب ميلي‌گرم (آمه ميا و همكاران، 1956)

تركيبات	غلظت برحسب ميلي گرم
سولفات منيزيم نيترات كلسيم سولفات سديم سديم دي هيدروژن فسفات يك آبه نيترات پتاسيم كلرور پتاسيم سولفات فرّيك سولفات منگنز يدور پتاسيم سولفات روي اسيد بوريك گلايسين اسيد نيكوتنيك ويتامين ب-1 ويتامين ب-6 ساكارز	360 200 200 5/16 0/80 0/85 5/2 5/4 75/0 5/1 5/1 0/3 5/0 1/0 1/0 0/20000

 

هنگامي كه مرحله رشد بر حسب تعداد روزهاي بعد از گلدهي تعيين شد، اين پروره ها از نظر آغاز مرحله كشت رويان با هم تفاوت پيدا كردند. با اين حال مشاهده شد هنگامي كه قسمت رويان نارس برحسب زمان گلدهي سبز مي شود، پريمورديم (primodium ) برگ‌پسين و لايه جذبي آن به اندازه كافي تمايز مي يابد. در نتيجه، آشكار شد كه زود ترين مرحله كشت موفقيّت آميز رويان نارس بايستي در دوره‌ي تمايز يابي برگ پسين باشد.

 علاوه بر گزارش‌هاي بالا، كشت رويان برنج در مؤسسه مركزي تحقيقات برنج Cuttac هند در سال‌هاي 1955 تا 1956 نيز انجام شد، اگرچه نتايج اين آزمايش‌ها انتشار نيافت(بوهار مونت،1961). شومه و بهادري(1982) مناسب‌ترين محيط غذايي كشت رويان کولتیوارهاي هندي را مطالعه كردند. آن‌ها اظهار

جدول 1-15. پروره هاي برنج زودرس و ديررس از نظر جوانه زني در محيط غذايي آگار.

پروره	تاريخ خوشه دهي	جوانه زني بعضي از رويآن‌ها	جوانه زني همة رويآن‌ها
نورين 20 ايكيو 132 شين ايلو كيو نورين 8 آساهي 1 زو يهو	25 ژوئن 21 اوت 25 اوت 4 سپتابر 9 سپتابر 13 سپتابر	(30)6 (55)7 (40)7 (30)7 (40)8 (30)9	8 9 11 11 12 14

توضيح: اين نتايج 7روز پس از آغاز كشت رويان يادداشت شد. تاريخ خوشه دهي در منطقة هيراتسوكاي ژاپن انجام شده‌است و اعداد داخل پرانتز درصد جوانه زني را نشان مي دهد.

 

داشتند كه رويان‌هاي 6- 5 روزه در محيط غذايي وايت با 4 % ساكارز به اضافه‌ي كازئين هيدروليزات هنگامي كه تحت دوره نوري 12 ساعت روشنايي در درجه حرارت 18-17 درجه سانتيگراد به مدت دوهفته و سپس در 20 درجه سانتيگراد به مدت دو هفته بعدي نگاهداري شود، جوانه زده و تا مرحله بلوغ رشد خواهد كرد. در مرحله نموّي اين رويان‌ها، بستگي به زمان كشت، در آن‌ها تفاوت‌هاي پروره اي (كولتيواري) وجود داشت. رويان‌هاي 5 روزه Aus و Bolo كه پروره هاي روز كوتاه هستند، فقط با كشت رويان‌هاي شش روزه‌ي پس از گلدهي توفيق حاصل گرديد. اين نتايج ايجاب مي كند كه زودترين مرحله براي كشت مؤفقيت آميز اين پروره ها در مقايسه با گزارش آمه ميا و همكاران(1956) حدود دو روز كمتر شده‌است. با اين حال، معلوم مي شود در تندي رشد رويان تفاوت پروره اي حاكم است(بوهار مونت، 1961). بنابر اين، هنوز قابل اطمينان نيست كه آيا در مرحله اوليه كشت مؤفقيّت آميز رويان‌هاي نارس  واقعاً تفاوت‌هاي پروره اي وجود دارد يا نه؟

 عموماً قطع كردن رويان نارس از تخمدان گياه برنج براي افراد مبتدي كار مشكلي است. به اين دليل كو(Ko) و همكاران(1983) يك روش عملي براي اين كار پيشنهاد كردند كه در آن پايه تخمدان را با دقّت بريده و با وارد كردن فشار از پشت آن، رويان به بيرون رانده مي شود.

 

كاربرد كشت جنين

موريشيما(1958) در اوريزا به روش كشت رويان عملاً دورگ‌هاي بين گونه اي را به طور مؤثري به دست آورد. گزارش آن‌ها براي اولين بار كاربرد كشت رويان را در دورگ گيري بين گونه‌اي اوريزا امكان پذير ساخت. در تلاقي بين زير‌گونه‌ي ژاپني و برنج وحشي، يا اوريزا مينوتا (minuta) و اوريزا اس‌پي پاراگوئه (paraguay) رويان‌هاي دورگ نابه‌هنجار هستند. به هر حال، بذور پوست كنده دورگ‌ها بر روي كاغذ صافي داخل پتريديش جوانه زده و به بلوغ رسيدند. بذور دورگ پروره‌هاي چهارلاد  ژاپني و برنج وحشي در درون‌دانه‌‌شان نشاسته ذخيره نكرده و بر روي كاغذ صافي هيچكدام از بذور به نشاءتبديل نشدند (جدول 1-16). با اين حال، هنگامي كه رويان هاي دورگ پروره‌هاي چهارلاد  و برنج وحشي در محيط غذايي وايت محتوي 2% ساكارز و 300 ميلي‌گرم بر ليتر كازيين هيدروليزات كشت گرديدند، همان طور كه در جدول 1-17 نشان داده شد گياهان دورگ حاصل گرديدند. اين نتيجه نشان مي‌دهد كه كشت رويان در دورگ‌گيري بين گونه‌اي برنج نيز تأثير دارد.بوهارمونت (1961) تأثير كشت رويان در توليد دورگ هاي برنج را تأييد كرد. گياهان دورگ از رويان هاي 12-7 روزه تلاقـــــــــــــــــــــــي هاي بين اوريزا ساتيوا (هندي) و گونـــــــــــــه‌هاي وحشي (,O.officinalis, O.perennis,O.Schweinsurthiana O. glaberrima, O. latifolia و O. stapfif) به روش كشت در محيط غذايي محتوي دكستروز به دست آمدند. او اشاره كرد كه كشت رويان خصوصاً در تلاقي بين اوريزا ساتيوا و اوريزا گلابريما امكان پذير است، درحالي‌كه درحالت عادي جوانه زني بذور دورگشان تأخير داشت يا پايين بود.‍‍

اين‌ها تنها گزارش هايي هستند كه در آن كشت رويان براي دورگ گيري بين گونه‌اي برنج به كار رفته است.‌‌ دليل وجود تعداد محدودي گزارش در باره‌ي كشت رويان دورگ در برنج آن است كه اگرچه بذور دورگ بر روي كاغذ صافي داخل پتريديش در شرايط دقيق خوب رشد مي‌كند و به دست آوردن گياهان دورگ كار خيلي مشكلي نيست. اما چون بسياري ازمحققان ازاين روش در مطالعات خود استفاده نكرده اند، مقاله هايي در اين زمينه انتشار نيافته است.

          بهادري وشوما (1982) قطعات رويان نارس را با استفاده از پرتودهي اشعه ايكس و سپس به روش كشت رويان رشد دادند. آن‌ها معلوم كردند كه حتي پرتودهي با پيمايش هاي پايين در القاي جهش‌دهندگي مؤثر واقع مي‌شود. علاوه براين ،آن‌ها پيشنهاد كردند كه احتمال شناسايي‌جهش‌يافته هاي غالب در نسل اول كشت رويان نارس در مقايسه با بذور رسيده بيشتراست.

   

افزايش بازدهي انتخاب: گياهچه‌هايي كه از ريزهاگ هاي تك لاد منشأ گرفته اند، داراي رخ مون‌هاي مشابه زاد مون هاي گياهان تك لاد دو برابر است. زيرا بروز رخ موني ژن هاي مغلوب به‌وسيله‌ي ژن هاي غالب مخفي نگاهداشته نمي‌شوند. از اين رو بازدهي انتخاب دراصلاح برنج به روش كشت بساك افزايش مي‌يابد، چون اين انتخاب در ميان جور تخم‌ها انجام مي شود . از طرف‌ديگردرزادگيري دودماني (پديگري) ، گياهان و خط‌هاي انتخابي ناجور تخمند.

 

 كاربرد زادگيري (Breeding) جهشي:  جهش يافته‌هايي كه در شرايط معيني انتخاب شده‌اند، در گياهان تمايز يافته بي‌درنگ خودشان را آشكار مي‌سازند.

آمه ميا و آكه مين (1863) توضيح دادند كه ميرندگي دورگ‌ها در تلاقي‌هاي دور گونه هاي اوريزا به توقف رشد ريشه‌ها مربوط است. براي هدف سازوكار‌هاي تحليلي اين ميرندگي دورگ‌هاي بين رقمي، آن ها از روش كشت رويان بذور دورگ استفاده كردند. بهادري و قوش (1965) از كشت رويان براي بررسي وراثت سازگان‌هاي ريشه‌ي برنج استفاده كردند.آن‌ها نتيجه گرفتند كه كشت رويان براي رشد سازگان‌هاي ريشه قابل استفاده مي‌باشد.

 جدول 1-16- جوانه زني بذور دورگ برروي كاغذ صافي مرطوب

تركيب والدين	تعداد بذور پاشيده شده	تعداد بذور جوانه زده	تعداد نشاءها
Rikuu 20X O.sp (Paraguay)	20	20	9
Norin 8 X        ,,	20	18	5
Rikuu 20X  O. minuta	23	18	6
Norin  8 X       ,,	20	16	5
Norin29(4x)X O.sp (paraguay)	10	1	0
“       X Rikuu 132 (4x)	10	3	0
Norin29(4x)X  O. min	10	0	0
Rikuu 132 (4x)  X      ,,	10	4	0

توضيح: دانه هاي پوست كنده برنج (برنج قهوه اي) پس‌از ضد عفوني برروي كاغذ صافي مرطوب داخل پتريديش پاشيده شدند.تعداد نشاء ها عبارت از گياهاني هستند كه تا مرحله‌ي انتقال به گلدان به رشد خود ادامه دادند.

 جدول 1-17جوانه زني بذور دورگ به روش‌كشت جنين

تركيب تلاقي‌ والدين	تعداد رويان‌هاي كشت شده	تعداد رويان‌هاي جوانه زده	تعداد نشاءهاي خوب رشديافته
Rikuu20XO.sp(paragu)	20	16	11
Norin8   X    ----	20	18	17
Rikuu20 X O.minuta	20	18	15
Norin8   X    ----	20	20	18
Norin29(4x)XO.sp(paragu)	4	4	3
Rikuu132(4x)X  -----	22	21	19
Norin29(4x)XO. Minuta	6	2	2
Rikuu 132 (4x)X-----	22	16	11

 توليد تك لادها به روش كشت تخمدان

 توليد تك لاد‌هاي ماده زاي  برنج از راه كشت تخمدان براي اولين بار در سال 1980 گزارش شد. زو  و يانگ (1980) اعلام كردند هنگامي‌كه تخمك‌هاي بارور نشده كشت شوند، پيش‌رويان‌ها به پينه القاء خواهند يافت و آن‌گاه به جوانه‌هاي نابجا‌ي شاخه تمايز مي يابند. تحقيق مفصّل اين فرآيند در دانشگاه ووهان چين به اجراء در آمد و نتايج آن توسّط زو  و همكاران (1986) تجديد نظر شد. خلاصه‌ي توليد تك‌لاد‌ها از طريق كشت تخمدان در اين جا براساس چنين تجديدنظري شرح داده مي شود. تشخيص مرحله‌ي مناسب كيسه‌هاي رؤياني براي توليد تك‌لادها بر پايه ريخت شناسي خارجي  تخمدان‌ها مشكل است. هنگامي كه ريزهاگ‌هاي بساك در مرحله‌ي اواخر تك‌‌هسته‌اي يا اوايل دوهسته‌اي باشند، تخمك‌ها در مرحله‌ي تك‌هسته‌اي يا چهارهسته‌اي خواهند بود. آزمايش‌هاي متعددي نشان دادند كه تخمدان‌ها در اين مرحله تك‌لادهارا به فراوني توليد مي‌نمايند.بنابراين، تخمين مرحله‌ي‌بهينه تخمدان‌ها براي كشت با آزمايش مرحله‌ي ريز هاگ‌هاي بساك امكان‌پذير است.

در عمل هنگامي كه فقط تخمدان ها كشت مي شوند، كيسه رؤيان پينه را توليد نمي‌كند. بنابراين، گل‌ها با پوشينه كامل يا بدون بساك مي‌توانند كشت شوند.در اين روش كشت گل‌هاي پوشينه دار بيشتر از كشت تخمدان مورد توجه است. پيش‌تيمار درجه حرارت پايين كه دركشت بساك مؤثر است، در كشت تخمدان ضروري نيست.

در كشت گل با پوشينه، همان محيط كشت بساك مورد استفاده قرار مي‌گيرد، اما محـتوي 3-6% ساكارز و  5/0 -125/0 ميلي‌گرم بر ليترMCPA   (2-متيل-4-كلروفنوكسي اسيد) است. استفاده از اين محيط كشت به روش كشت شناور گل‌هاي پوشينه دار توصيه شده است.

ماده زايي در پروره‌‌هاي ژاپني بين 5/1 تا 12% و در پروره‌هاي هندي بين صفر تا 8/2% متفاوت است.اعتقاد بر اين است كه القايابي پينه در پروره‌هاي ژاپني سريع‌تر از نوع هندي مي‌باشد.

پينه‌هاي حاصل از كشت تخمدان به محيط غذايي كشت تخمدان كه پيش ازاين بيان گرديد با 5/0 ميلي‌گرم بر ليتر IAA ، 25/0 ميلي‌گرم بر ليتر NAA  و 2 ميلي‌گرم بر ليتر كينتين يا 033/0ميلي‌گرم بر ليتر MCPA براي تمايزيابي جوانه‌هاي نا‌بجا انتقال داده شدند.بين محيط‌هاي غذايي مايع ونيمه جامد تفاوتي مشاهده نشد. نتايج آزمايشي متعددي نشان دادند كه 60-30 % پينه‌ها به جوانه‌هاي نابجا تمايز يافته و سپس نوشاخه‌ها را توليد كردند. از محيط غذايي محتوي 5/1% ساكارز و 5/0 % NAA براي براي ريشه دهي استفاده شد. افزايش 1/0 % زغال فعّال به اين محيط غذايي، رشد ريشه‌ها را بهبود بخشيد. تحليل ياخته‌شناسي حدود يك‌صد گياه حاصل از كشت تخمدان ثابت كردكه 5/77 % اين گياهان تك‌لاد و 5/22 % آن‌ها دولادند. گياهان پرلاد و بي‌هولادي شناخته نشدند. فرواني توليد تك‌لاد‌ها با اين روش بيشتر از كشت بساك است. علاوه براين، زالي‌ها در كشت بساك برنج بيشتر مشاهده مي‌شوند. از طرف ديگر، 90-80 % نشاء‌هاي مشتق از كشت تخمدان سبز بودند. اگرچه از نظر وقوع زالي‌ها تفاوت پروره‌اي وجود اشت، حداكثر پديدآمدن آن‌ها در كشت تخمدان در حدود 30 % بود، كه كمتر از كشت بساك است. خاستگاه پينه در كشت تخمدان به روش ياخته شناسي آزمايش شد(زو و يانگ،1981 ؛ تيان ويانگ،1983 ). در كشت تخمدان، كيسه‌هاي روياني با مرحله‌ي تك هسته‌اي تا چهارهسته‌اي به كيسه‌هاي رؤياني رسيده كه هريك داراي يك ياخته‌ي تخم‌زا، ياخته‌هاي قرينه، ياخته‌هاي مركزي و ياخته‌هاي متقاطر از چهار روز پس از تلقيح ، تكوين يافتند.در هريك از اين ياخته‌هاي كيسه‌ي رؤياني، تقسيم ياخته‌اي به وقوع پيوست، باتوجّه به اين كه دو ياخته به ندرت به طور هم‌زمان تقسيم مي‌شدند.در اين تقسيم‌ها گاهگاهي انواع ياخته‌هاي نابهنجار توليد مي‌شدند كه شامل ياخته‌هاي با هسته‌ي آزاد، مانند ياخته‌هاي درون دانه(آندوسپرم) يا يك دسته ياخته‌هاي واكوئول دار بودند. از طرف ديگر، پيش‌رؤيان‌هاي مركب از ياخته‌هاي كوچك با پيش دشتي هاي زياد نيز گاهي اوقات توليد شدند.

همان‌طور كه در شكل1-18 نشان داده شد، بيشترين پيش‌جنين‌‌هاي برنج از ياخته‌هاي قرينه  و متقاطر مشتق شده‌اند. در اين حالت، پس از تقسيم بيدرنگ تشكيل پيش‌جنين‌‌ها برحسب پيش چيرگي شان آغاز مي‌شود. بنابراين، پينه‌‌هاي كه از كشت تخمدان توليد مي‌گردند، غالباً از ياخته‌هاي قرينه منشأ يافته اند.                 

جدول1- 18  تقسيم ياخته‌هاي كيسه‌جنيني به روش‌كشت تخمدان.

ياخته‌هاي كيسه روياني	تعداد تقسيم	انواع ياخته هاي تقسيم شده ــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــ فاقد هسته            ياخته واكوئول‌دار         پيش رويان
ياخته تخم‌زا ياخته‌هاي قرينه ياخته مركزي ياخته‌هاي متقاطر	73 250 22 16	67                               6                             0 13                             21                           216 2                                0                               0 0                                0                               16

توضيح: در اين آزمايش تعداد 361 كيسه روياني مورد بررسي قرار گرفته است.

بخشي از اين پيش‌جنين‌ها كه 15-12روز پس از كشت، فرايند جنين‌زايي مربوط به تمايزيابي و تشكيل غلاّف ساقه را امكان‌پذير ساختند، پيش بنه مانند بودند. اين پينه‌ها براي توليد جوانه‌هاي نابجا به محيط‌هاي غذايي ديگري انتقال يافتند.

فرآيند توليد تك لاد ها با استفاده از مشاهدات فوق به صورت زير خلاصه مي‌شود:

كيسه جنيني4-1 ياخته‌اي< كيسه جنيني رسيده < تقسيم قرينه‌ها < پيش‌جنين‌ها < پينه‌ي پيش‌بنه مانند<  تمايزيابي جوانه‌هاي نابجا و ريشه‌ها < گياهچه‌هاي تك‌لاد.

          اين نتايج احتمال فراهم شدن تك لاد‌هاي ماده زاي برنج را نشان مي‌دهد. روش اخير در مقايسه با روش كشت بساك از نظرتوليد گياهان زال پايين‌تر حايز اهميّت بسياري است. بازدهي اين دوروش در توليد تك لاد‌ها قابل مقايسه بايكديگر نيستند، زيرا يك بساك محتوي چندين هزاردانه  گرده است درحالي كه يك تخمدان فقط يك كيسه‌ي رؤياني دارد(زو و همكاران، 1986). بنابراين، از نظر زادگيران‌گياهي، كشت بساك بيشتراز كشت تخمدان بازدهي دارد، زيرا دركشت تخمدان، قطع كردن گل‌هاي پوشينه‌دار كار خسته كننده اي مي باشد. با به حساب آوردن سرعت پايين تشكيل پينه دركشت تخمدان، كه حداكثر 22 % است، و عمل دشوار كشت گل‌ها در محيط غذايي، بازدهي كل توليدگياهان تك لاد در كشت بساك به ويژه كشت گرده هنوز به اندازه‌ي كافي بالاتر است  (10).

 

4-كاربرد كشت تخمدان

          كشت تخمدان براي آزمايش سنتز پروتيين و RNA در فرآيند جنين‌زايي، رديابي اوريدين و لئوسين نشانه گذاري شده نيز مورد استفاده قرار مي گيرد.

          يو و همكاران (1986)گرده افشاني داخل لوله آزمايش را براي دورگ گيري بين رقمي به كار بردند و گياهان دورگ با فراواني بالايي را (75 %) توليد كردند. براي آشكار كردن كلاله ها ، گل‌ها به اندازه‌ي يك سوّم از بالا بريده و سپس در محيط غذايي كشت گرديده و گرده دهي ‌شدند. اين روش كار بيشتر به كشت دانه معروف است(10)، (تصوير7).

 

 

نقش كشت بافت در توسعه تحقيقات برنج

پروتوپلاست‌ها یا پيش دش هاي برنج و همجوشي ياخته‌اي‌

1- جدا سازی پروتوپلاست ها

همجوشي‌ياخته‌اي‌وبرگيري‌ (واردكردن ) ژن‌هاي خارجي توسط ياخته‌ها با استفاده از دست ورزي پروتوپلاست های حاصل‌از‌حذف آنزيمي ديواره مي‌تواند عملي‌باشد. پروتوپلاست‌ها براي تبديل كنندگي اندامك‌هايي مانند غشاي پلاسمايي، هسته‌ها كلروپلاست‌ها و ميتوكندري‌ها منابع مفيدي هستند. پروتوپلاست ها معمولاً از بافت‌هاي‌گياهي مختلفي نظير برگ‌ها، گلبرگ‌ها، ساقه‌ها، ريشه‌ها، زير لپه‌ها، گرده‌ها، و كشت پينه‌ها و سوسپانسيون ياخته‌اي جدا مي‌شوند. جدول‌هاي 2-1 و 2-2 و شكل 2 آنزيم هاي تجارتي و روش كار جداسازي پروتوپلاست ها را به ترتيب نشان مي‌دهند. روش كار رسمي جدا سازي پيش دش‌هاي برنج (يك گياه تك لپه‌اي) اساساً مشابه‌ي گياهان دولپه‌اي است، با در نظر گرفتن اين كه تهيه مستقيم مقدار زيادي پروتوپلاست از بافت‌هاي برنج و كشت آن‌ها مشكل است. در عوض، پروتوپلاست هاي داراي قابليت تقسيم ياخته‌اي و باززايي از پينه‌هاي حاصل از بافت‌هاي گياهي در شرايط مناسب مي‌توانند جدا شوند. توفيق در دست ورزي پيش دش‌هاي برنج به طورقطعي بستگي به چگونگي تهيه مواد منابع گياهي خوب (پينه‌ها) دارد.

در اين قسمت، مواد گياهي و جدا سازي و خالص كردن  پيش دش‌هاي برنج بر پايه‌ي گزارش‌هاي متعدد جديدي تشريح مي‌گردد، كه در آن باززايي گياهي از پروتوپلاست ها نيز نشان داده مي‌شود(10)

الف-روش‌هاي تهيه پروتوپلاست از پينه‌ي ‌بذر

1 - روش تامپسون و همكاران (1986) و عبداله و همكاران( 1986)

1-1. بذورپروره‌هاي تايپه 309 و فوجي ساكا 5  در محيط غذايي Ls (لينس ماير و اسكوگ 1965)، محتوي 5/2 ميلي‌گرم بر ليتر 2,4-D ، يك ميلـــــــي‌گرم بر ليتر تيامين HCl- و 3% ساكارز و 8/0 % آگار (5/5 pH) كشت مي‌شود.

2-1. پس از 4 هفته پينه سپرچه را انتخاب كنيد. پينه‌ها به يك محيط غذايي مايعي (با همان تركيب محيط غذايي القاي پينه) انتقال يافته و بر روي دستگاه تكان دهنده مكانيكي با سرعت 80 دور بر دقيقه تكان داده مي شود. كشت تعليقي را هر  5-3 روز از يك صافي نايلوني (um500 عبور مي‌دهند تا دسته‌هاي ياخته‌اي بزرگ جدا شوند و به آن محيط تازه اضافه نماييد.

3-1 فعال‌ترين ياخته‌هاي تكثير شده به يك محيط غذايي مايع AA انتقال يابند.

4-1 هر 7 روز يك بار با تعويض يك چهارم محيط غذايي كشت تعليقي ياخته‌اي با محيط جديد آن را واكشت مي‌كنند.

 جداسازي و خالص كردن  پروتوپلاست ها

  5-1 با صاف كردن كشت تعليقي ياخته‌اي از راه صافي نايلوني (um250) دو روز پس از واكشت مقدار يك گرم ياخته جمع آوري مي‌شود.

6-1 به اين ياخته‌ها مقدار 20 ميلي ليتر محلول آنزيمي افزوده و در 23 درجه‌ي سانتيگراد  به مدت 3 ساعت با سرعت 40 دور بر دقيقه تكان مي‌دهند و سپس مدت 3-2 ساعت در 27 23 درجه‌ي سانتيگراد  بي حركت  مي‌گذارند.

7-1  كشت تعليقي ياخته‌اي پيش‌دش را با يك صافي نايلوني (um30) صاف كـرده و با  g ×80 به مدت 5 دقيقه ميان گريز مي‌كنند.

8-1 پيش‌دش‌ها  را با محلول شستشوي (CPW) محتوي 2/27 ميلي‌گرم بر ليتر KH2PO4، 101 ميلي‌گرم بر ليتر KNO3، 1480 ميلي‌گرم بر ليتر Cacl2.2H2O، 246 ميلي‌گرم بر ليتر MgSO4.7H2O، 16/0 ميلي‌گرم بر ليتر KI، 025/0 ميلي گرم بر ليتر CaSO4.5H2O، 13% مانيتول، 8/5pH  شستشوداده و سپس ميان‌گريز(سانتريفيوژ) مي نمايند.

2- روش كولي بالي و دمارهي(1986)

 1-2 بذور بر روي محيط غذايي MS (موراشيج و اسكوك، 1962) محتوي 2 ميلي گرم بر ليتر 2,4-D و 4-10 مولار Fe-DETA با ويتامين‌هاي مورل و وتمور (1951) كه با 8/0% آگار نيمه جامد شده كشت مي‌شوند.

2-2 پس از 3 روز از پايه غلاف ساقه، پينه تشكيل مي‌شود. يك ميلي‌متر غلاف ساقه و پينه دهنده را به مدت 3 ساعت در محلول شامل:  2/27 ميلي‌گرم بر ليتر KH2PO4 ، 5/101 KNO3، 148 CaCl2.2H2O، 247 MgSO4.7H2O، 16/0 KI، 025/0 CuSO4.5H2O و 13% مانيتول و  4/5pH غوطه‌ور مي‌‌سازند تا عمل دشته‌كافتي (پلاسموليز) وقوع يابد.

3-2 پينه‌ها را به محيط غذايي (Kuo and Michayluk, 1975) KM داراي 2 ميلي گرم بر ليتر 2,4-D و 2/0 ميلي گرم بر ليتر BAP انتقال داده  و  با سرعت rpm110 در 25 درجه‌ي‌سانتيگراد در تاريكي تكان مي‌دهند.

 جدا سازي و خالص كردن پروتوپلاست ها

 4-2 - به وسيله‌ي تيمار كردن اين پينه‌ها با محلول آنزيمي (b) به مدت 20 ساعت پيش دش‌ها را  تهيّه مي‌كنند. كشت تعليقي‌پيش‌دش‌ها را با عبور از صافي نايلوني (um38) صاف كرده و سپس ميان گريز مي‌نمايند.

پس از دور ريختن محلول رويي، محيط غذايي KM به آن افزوده و به منظور تخليص پيش‌دش‌ها ميان‌گريز مي‌نماييد. ميزان پيش دش‌ها تحت تأثير سن پينه قرار مي‌گيرند : موقعي كه از پينه 3 روزه استفاده مي‌شود. بهترين نتيجه حاصل مي‌گردد.

3- روش‌كيوزوكا و همكاران (1978)

 1-3 - بذوركولتيوارهاي نيپون بار وايوايموشي يا رويانهاي نارس كولتيوارهاي نورين 14 و ايوايموشي نمونه برداري‌شده در 10-5 روز پس از گرده افشاني را در محيط غذايي MS با 2 ميلي‌گرم برليتر 2,4-D كشت مي‌دهند.

2-3 - پس از مدت 3 هفته پينه سپرچه تشكيل مي‌شود. پينه‌ها را به يك محيط غذايي مايع R2 محتوي 6/5 ميلي گرم بر ليتر FeSO4، 5/7 ميلي گرم بر ليتر Na2EDTA، ويتامنيهاي MS و يك ميلي‌گرم بر ليتر 2,4-D انتقال مي‌دهند. كشت‌ها را بر روي دستگاه تكان دهنده با سرعت rpm50 نگاهداري مي‌كنند.

3-3 - هر هفته واكشت مي شوند.

 جداسازي و خالص كردن پروتوپلاست ها

 4-3 - پس از ساكن گذاشتن ياخته‌هاي سوسپانسيون با محلول آنزيمي (C ) در cْ30 به مدت 7-3 ساعت، سوسپانسيون پروتوپلاست را از صافي نايلوني (um20) عبور مي‌دهند و به مدت 10 دقيقه با rpm80  ميان گريز مي‌كنند.

5-3 - پس از خالي كردن محلول رويي، محلولKMC را به آن مي‌افزايند و مدت 4 دقيقه با همان سرعت ميان گريز كرده و  اين عمل شستشو را دو بار تكرار مي‌كنند. توضيح اين كه آن‌ها از صافي نايلوني u20 استفاده‌كردند زيرا قطر پروتوپلاست‌‌هاي برنج خيلي‌كوچك است.ميزان‌ پروتوپلاست ‌ها 6 10×5-4 عدد بر هرگرم ياخته مي‌باشد كه بستگي به پروره و خاستگاه پينه دارد(10).

 ۵- روش فوجي مورا و همكاران (1985)

 1-5 - پينه ترد مشتق از رويان رسيده (پروره‌ي نيپون بار) و رويان نارس (پروره‌ي ساساني شي‌كي) را انتخاب كرده و اين پينه ها را به محيط غذايي مايع (Ohira el al. 1973) R2 محتوي ويتامين‌هاي B5(گامبوگ و همكاران 1968)، 3/0 % كازئين هيدروليزات، 1 ميلي‌گرم بر ليتر 2,4-D و 3% ساكارز انتقال داده و اين كشت را در cْ25 تحت نور دايمي (500 لوكس) با سرعت rpm60 درتكان دهنده قرار مي‌دهند.

2-5 -  هر هفته يك بار واكشت مي‌كنند.

 جدول 20-2- تركيبات محلول‌هاي آنزيمي مورد استفاده براي جداسازي پيش دش‌هاي برنج

 

مثال آزمايشي	آنزيم هاي مورد استفاده	غلظت
a	Cellulase Onozuka Rs	%1
“	Pectolyase Y23	%0.1
B	Cellulase Ono Zuka P10	%1
“	Macerozyme R10	%1
“	Dricelase	%0.6
“	Pectolyase	%0.5
“	Mannitol	%5.5
“	Sorbitol	%5.5
C	Cellulase Onozuka Rs	%4
“	Macerozyme R10	%1
“	Mannitol	%0.4
D	Macerozyme R10	%1
“	Cellulase Rs	%4
“	CaCl2.2H2O	%0.5
“	Potassium dextrasulfate	%0.5
“	Mannitol	0.4M
E	Macerozyme R10	%2
“	Macerozyme R10	%2
“	Pectolyase Y23	%0.1
“	Dricelase	%0.1

 

 جدا سازي و خالص‌كردن پروتوپلاست ‌ها

3-5 - يك گرم ياخته را 5 روز پس از واكشت به مدت 30 دقيقه در cْ27 با سرعت rpm40 ميان گريز مي‌نمايند. پس از 3 ساعت ساكت نگهداشتن، سوسپانسيون پيش دش را با عبور از يك صافي نايلوني صاف مي‌كنند و مدت 5 دقيقه در g × 50 ميان گريز مي‌نمايند.

4-5 -  پيش دش‌ها را 4 بار  با محيط غذايي مايع R2 داراي 4/0 مولار ساكارز شستشو مي دهند.

  روش‌يامادا و همكاران (1986)

  1-6 - بذور 58-A ، يك خط نرعقيم سيتوپلاسمي را روي محيط غذايي LS (لينن ماير و اسكوگ، (1965) محتوي um20 ، 2,4-D  و 3 درصد ساكارز و كه با 2% آگار نيمه جامد شده است كشت مي‌دهند و در cْ25 در تاريكي نگهداري مي‌نمايند.

2-6 - پس از 40 روز كشت، پينه‌ها به محيط مايعي انتقال‌يافته و سپس برروي يك تكان دهنده چرخشي با سرعت rpm100 تكان داده مي‌شود و هر 3 روز يكبار با محيط تازه شستشو مي‌شود.

هنگام واكشت، خط‌هاي ياخته‌اي غني از نظر سيتوپلاسم و با رشد زياد را انتخاب مي‌كنند.

 جداسازي و خالص‌كردن پروتوپلاست ‌ها

   3-6 - ياخته‌ها را 3 روز پس از واكشت در محلول آنزيم (e) به مدت 9 ساعت نگاهداري مي‌نمايند.

4-6 - سوسپانسيون پروتوپلاست را از صافي نايلوني (um40) عبور داده و سپس مدت 4 دقيقه با سرعت g × 250  ميان گريز مي‌كنند.

5-6 - پيش دش‌ها را 3 مرتبه با محيط غذايي LS محتوي 8/0% سرم گاوي و  mM80  پتاسيم كلريد، يك آبه ( CaCl2­. H2O)  وmM125، Mgcl2 و mM5/0 ، MES و M3/0 گلوكز شستشو مي‌دهند. سرانجام، سوسپانسيون را از صافي نايلوني عبور داده مي‌شود.

نقش كشت بافت در توسعه تحقيقات برنج

 روش‌هاي استخراج پروتوپلاست‌ها از پينه بساك

1- روش توري‌ياما و همكاران (1986)

 1-1 - پيينه‌ها را از بساك‌هاي پروره‌ي ياماهوشي در مرحله‌ي گرده تك هسته‌اي به روش استاندارد كشت بساك يا روش‌هاي كشت سنبله (توري‌ياما و هيناتا، 1985) تهيه مي‌كنند. از محيط غذايي N6 يا AA با آگار نيمه جامد شده هر كدام محتوي 2 ميلي گرم بر ليتر 2,4-D براي كشت بساك و محيط غذايي مايع AA با 2 ميلي گرم 2,4-D براي كشت سنبله استفاده  مي‌نمايند.

2-1 - پينه‌ها را در يك محيط غذايي مايع AA با سرعت حركت چرخشي rpm120 نگاهداري مي نمايند.

3-1- هر 14 روز يك چهارم محيط غذايي سوسپانسيون را با محيط تازه جابه جا مي‌كنند.

 

 

جدا سازي و خالص‌كردن پروتوپلاست ‌ها

  4-1 - پس از مدت زمان 7-4 روز سوسپانسيون را با محلول آنزيم (f) به مدت 5/1 ساعت در cْ25 با سرعت rpm60 تكان دهيد. سوسپانسيون پروتوپلاست را به مدت 5/1 ساعت ساكن نگاهداريد.

سوسپانسيون پروتوپلاست را از الك نايلوني (um30) عبور دهيد و مدت زمان 3 دقيقه با g × 100 ميان گريز نماييد.

پروتوپلاست را 3 مرتبه با محلول مانيتول 5/6% محتوي 1/0% CaCl₂.2H₂O شستشو دهيد. عامل اصلي اين روش عبارت است از كشت پينه در محيط غذايي AA. از بيش از 90% ياخته‌هاي سوسپانسيون مي‌توان پيش دش را جدا كرد .

همانطور كه گفته شد، جداسازي خوب پروتوپلاست هاي برنج مستلزم انجام كشت‌هاي سوسپانسيون ياخته‌اي مناسب و انتخاب دقيق مرحله رشد  کولتیوار‌هاي ياخته‌اي منابع گياهي است.

 

كشت پروتوپلاست ‌ها وهمجوشي‌آن‌ها

          روش‌هاي‌كشت پيش دش و باززايي گياه از پيش‌دش‌هاي حاصل از ياخته‌ها در گونه‌هاي گياهي تفاوت دارد. اين فنون در بعضي از گونه‌هاي گياهان دولپه‌اي نظير توتون به‌خوبي استمرار يافته است. با اين حال، در غلاتي مانند: برنج، گندم و ذرت كه منبع مهم انرژي براي حيوانات و انسان را تأمين مي‌كنند، هنوز دوران توسعه و پيشرفت خود را مي‌گذراند. جدا سازي پيش‌دش‌ها در برنج آسان نيست. تا سال 1985 نتايج مؤفقيت آميز بسيار اندكي در باره‌ي تقسيم ياخته و تشكيل پينه از كشت پيش دش‌ها گزارش شده بود. در دوره‌ي 1987-1985، توسط فوجي مورا و همكاران (1985)، يامادا و همكاران(1986)، توري‌ياما و همكاران(1986)، عبداله و همكاران (1986) و كيوزوكا وهمكاران (1987) دستاوردهاي متعددي در كشت پيش‌دش و باززايي گياهي از پيش‌دش‌هاي حاصل از ياخته‌ها به‌طور موفقيت آميزي گزارش شد. براساس روش‌هاي توسعه‌يافته، عمليات همجوشي پيش دش و انتقال ژن در برنج به‌طور موفقيت آميزي تحقق يافته است.

به منظور اجراي مؤثر باززايي گياه از پروتوپلاست پينه‌ها، مراحل ضروري زير بايستي انجام شود :

الف- تهيه لاين‌‌هاي ياخته‌اي مناسبي براي جدا كردن پيش‌دش‌ها

 پينه‌ها از سپرچه بذور رسيده، جنين نارس و بساك حاصل مي‌شوند. از طريق كشت بر روي محيط‌هاي غذايي‌نيمه جامد شده با آگار و محتوي اكسين (4-1 ميلي گرم بر ليتر 2,4-D كه در حالات متعددي متغيّر است)، پينه‌ها را توليد مي‌گردند. سپس اين توده‌هاي پينه‌اي به محيط غذايي مايعي منتقل مي‌شوند و براي تهيه سوسپانسيون ياخته‌اي در يك‌ تكان‌دهنده برقي قرار مي‌گيرند. با استفاده از اين روش كارها، خط‌هاي ياخته‌‌اي حاصل مي‌گردند كه‌ مستعد آزاد شدن پيش‌دش‌هاي فراوانند.

ب- جداسازي پيش‌دش‌ها از خط‌هاي ياخته‌اي كشت شده

پيش دش‌ها يا پروتوپلاست ها با برداشتن ديواره ياخته‌اي به طريق آنزيمي مي‌توانند تهيه شوند.

ج- كشت پيش‌دش‌ها

پيش‌دش‌هاي جدا شده براي تشكيل مجدد پينه در محيط غذايي مناسبي كشت مي‌شوند. فشار گذرندگي (اسمزي) اين محيط غذايي بايستي به طور صحيح تنظيم شده باشد.

د- باززايي پروتوپلاست ها(پيش‌دش‌ها )

براي باززايي گياه، پينه‌ها در محيط غذايي فاقد تنظيم كننده رشد كشت مي‌شوند. بعضي اوقات از محيط غذايي محتوي سيتوكنين با غلظت يك ميلي گرم در ليتر كنيتين استفاده مي‌شود.

در قسمت‌هاي زير، اين چهار مرحله به‌طور مفصّل تشريح مي‌گردند :

 

تهيّه لاین هاي ياخته‌اي براي جداسازي پيش‌دش:

در برنج، همه‌ي موارد موفقيت آميز براي باززايي گياهان از راه كشت پيش‌دش فقط با استفاده از كشت ياخته‌ها به عنوان منبع جداسازي آن‌ها انجام شده است. تاكنون از كشت ياخته‌هاي ميانبرگ (مزوفيل) توفيقي حاصل نگرديده است. بنابراين، اعتقاد براين است كه توفيق در كشت پيش‌دش با بنانهادن يك خط ياخته‌اي مناسب، عامل كليدي مهمّي‌ باشد. ياخته‌ها براي كشت موفقيت آميز پيش‌دش بايستي در محيط غذايي سوسپانسيون كاملاً معلق گردند و قابليت تقسيم شوندگي بالايي را حايز باشند.

براي به دست آوردن پيش‌دش‌ها، تدابير ويژه‌اي در انتخاب خط‌هاي ياخته‌اي مناسب و محيط‌هاي غذايي كشت ضروري است. در اين باره در ژاپن كوشش‌هاي چندي صورت گرفته است. براي مثال، در سال 1985 توسط فوجي مورا و همكاران يك خط ياخته‌اي با باززايي بالا و قابليت توليد پيش‌دش‌هاي زياد در اثر انتخاب پينه‌هاي ترد (خرد شونده) حاصل گرديد. يامادا و همكاران (1986) اهميت انتخاب ياخته‌هاي غني از نظر مواد سيتوپلاسمي با توانايي تكثير شوندگي زياد را توصيه نمودند. براي تهيه سوسپانسيون ياخته‌اي بخوبي پراكنده شده، محيط غذايي AA  توصيه شد تا ميزان توليد زياد پيش‌دش‌ها بسهولت انجام شود (توري‌ياما و هيناتا 1985، تامپسون و همكاران 1986). در اين آزمايش، محيط غذايي AA فقط از چهار نوع اسيد آمينه بعنوان منبع نيتروژن تشكيل مي‌شد : گلوتامين، اسيد آسپارتيك، آرژنين و گلايسين به جاي تركيبات نيتروژن معدني، پس از موفقيت كشت در اين محيط غذايي، پينه‌هاي تعليقي به توده‌هاي ريز 20-10 ياخته‌اي با تكثير شوندگي فعال توسعه يافتند كه پيش دش‌هاي فراواني بطور فعال توانستند ازدياد يابند و از آن‌ها پيش‌دش‌هاي زيادي جدا شد. 5-4 روز پس از شروع هر واكنش در يك محيط غذايي تازه از ياخته‌هاي معلق پيش‌دش‌هاي كافي جدا شدند. كيوزوكا و همكاران (1987) نشان دادند كه گاهي اوقات، پيش‌دش‌ها از پينه‌هاي اوليه جدا مي‌شدند. جدول 2-2 چندين حالت موفقيت آميز جداسازي پيش‌دش را در كشت ياخته نمايش مي‌دهد.

 

 

جدول 2-2- نمونه‌هاي كشت ياخته‌ براي جدا كردن پيش‌دش‌ها در برنج

پروره و اندام نمونه  كشت	محيط غذايي كشت	مرجع
Nipponbare )سپرچه) Susanishiki (رويان نارس)	محيط غذايي R2 و ويتامين B5 و يك ميلي گرم بر ليتر 2,4-D و كازيين هيدروليزات 3/0%	فوجي‌مورا و همكاران ، 1985
A-58MS Fujiminory (بذر)	محيط غذايي LS   با  M 5-10×2 2,4-D	يامادا و همكاران، 1986
Yamahoushi (بساك)	محيط غذاييAA(1 و يك ميلي‌گرم‌بر ليتر  2,4-Dو  2/0 ميلي گرم بر ليتر كينتين و 1/0 ميلي‌گرم بر ليتر GA3	توري‌ياما، 1986
Taipei 309 Fujisaka 5 (پايه برگ نشاء)	محيط غذاييAA(2 و دو ميلي‌گرم‌بر ليتر 2,4-D  و 2/0 ميلي گرم بر ليتر كينتين  و 1/0 ميلي‌گرم بر ليتر GA3	عبداله و همكاران، 1986
Nipponbare Norin 14 (رويان نارس)	محيط غذايي R2  با  ويتامين MS و 2 ميلي‌گرم بر ليتر 2,4-D	كيوزوكا و همكاران، 1987

 

(1): محيط غذايي B5 با حذف سولفات آمونيوم و نيترات سديم و افزودن 876 ميلي گرم بر ليتر گلوتامين، 266 ميلي گرم بر ليتر اسيد آسپارتيك، 174 ميلي گرم بر ليتر آرژانتين، 5/7 ميلي گرم بر ليتر گلاسيين و 95/2 گرم بر ليتر كلريد سديم، تغيير داده شد.

(2): محيط غذاييMS   با حذف سولفات آمونيوم و نيترات سديم و افزودن 877 ميلي گرم بر ليتر گلوتامين، 266 ميلي گرم بر ليتر اسيد آسپارتيك، 288 ميلي گرم بر ليتر آرژنين، 75 ميلي گرم بر ليتر گلاسيين و 94/2 گرم بر ليتر كلريد سديم، تغيير داده شد.